תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
וקטורי גנים לטיפול בסיסטיק פיברוזיס ריאתי חייבים להיות ממוקדים לדרכי הנשימה המוליכות, שכן להתמרה של ריאות היקפית אין השפעה טיפולית.היעילות של התמרה ויראלית קשורה ישירות לזמן השהייה של הנשא.עם זאת, נוזלי אספקה ​​כגון נושאי גנים מתפזרים באופן טבעי לתוך המכתשים במהלך השאיפה, וחלקיקים טיפוליים מכל צורה מוסרים במהירות על ידי הובלה רירית.הארכת זמן השהייה של נשאי גנים בדרכי הנשימה חשובה אך קשה להשגה.חלקיקים מגנטיים מצומדים לנשא הניתנים לכיוון פני השטח של דרכי הנשימה יכולים לשפר מיקוד אזורי.עקב בעיות בהדמיה in vivo, ההתנהגות של חלקיקים מגנטיים קטנים כל כך על פני דרכי הנשימה בנוכחות שדה מגנטי מופעל אינה מובנת בצורה גרועה.מטרת מחקר זה הייתה להשתמש בהדמיית סינכרוטרון כדי לדמיין את תנועתם של סדרה של חלקיקים מגנטיים בקנה הנשימה של חולדות מורדמות על מנת לחקור את הדינמיקה ודפוסי ההתנהגות של חלקיקים בודדים וחלקיקים בתפזורת in vivo.לאחר מכן הערכנו גם האם מסירה של חלקיקים מגנטיים לנטי-ויראליים בנוכחות שדה מגנטי תגביר את יעילות ההתמרה בקנה הנשימה של החולדה.הדמיית רנטגן סינכרוטרון מראה את התנהגותם של חלקיקים מגנטיים בשדות מגנטיים נייחים ונעים במבחנה ובאינבו.לא ניתן לגרור חלקיקים בקלות על פני דרכי הנשימה החיים באמצעות מגנטים, אך במהלך ההובלה, משקעים מתרכזים בשדה הראייה, שם השדה המגנטי החזק ביותר.יעילות ההתמרה גדלה גם פי שישה כאשר חלקיקים מגנטיים לנטי-ויראליים נמסרו בנוכחות שדה מגנטי.יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שחלקיקים מגנטיים לנטי-ויראליים ושדות מגנטיים עשויים להיות גישות חשובות לשיפור מיקוד וקטור גנים ורמות התמרה בדרכי הנשימה המוליכות in vivo.
סיסטיק פיברוזיס (CF) נגרמת על ידי וריאציות בגן בודד הנקרא CF transmembrane conductance regulator (CFTR).חלבון CFTR הוא תעלת יונים הקיימת בתאי אפיתל רבים בכל הגוף, כולל דרכי הנשימה, אתר מרכזי בפתוגנזה של סיסטיק פיברוזיס.פגמים ב-CFTR מובילים להובלת מים לא תקינה, להתייבשות של פני דרכי הנשימה ולירידה בעומק שכבת נוזל משטח הנשימה (ASL).זה גם פוגע ביכולת של מערכת ההובלה המוקוציליארית (MCT) לנקות את דרכי הנשימה מחלקיקים ומחוללי מחלות נשאפים.המטרה שלנו היא לפתח טיפול גנטי לנטי-ויראלי (LV) כדי לספק את העותק הנכון של הגן CFTR ולשפר את בריאות ASL, MCT ובריאות הריאות, ולהמשיך לפתח טכנולוגיות חדשות שיכולות למדוד פרמטרים אלו in vivo1.
וקטורי LV הם אחד המועמדים המובילים לטיפול גנטי בסיסטיק פיברוזיס, בעיקר בגלל שהם יכולים לשלב באופן קבוע את הגן הטיפולי בתאי הבסיס בדרכי הנשימה (תאי גזע בדרכי הנשימה).זה חשוב מכיוון שהם יכולים לשחזר הידרציה ופינוי ריר נורמליים על ידי התמיינות לתאים פונקציונליים של דרכי הנשימה המתוקנים בגנים הקשורים לסיסטיק פיברוזיס, וכתוצאה מכך תועלות לכל החיים.וקטורי LV חייבים להיות מכוונים נגד דרכי הנשימה המוליכות, מכיוון שכאן מתחילה מעורבות הריאות ב-CF.מסירה של הווקטור עמוק יותר לתוך הריאה עשויה לגרום להתמרה מכתשית, אך אין לכך השפעה טיפולית בסיסטיק פיברוזיס.עם זאת, נוזלים כגון נושאי גנים נודדים באופן טבעי לתוך המכתשים בשאיפה לאחר לידה3,4 וחלקיקים טיפוליים נפלטים במהירות לחלל הפה על ידי MCTs.היעילות של התמרה LV קשורה ישירות למשך הזמן בו הווקטור נשאר קרוב לתאי המטרה כדי לאפשר קליטה תאית - "זמן שהייה" 5 אשר מתקצר בקלות על ידי זרימת אוויר אזורית טיפוסית וכן ספיגה מתואמת של ריר וחלקיקי MCT.עבור סיסטיק פיברוזיס, היכולת להאריך את זמן השהייה של LV בדרכי הנשימה חשובה להשגת רמות גבוהות של התמרה באזור זה, אך הייתה מאתגרת עד כה.
כדי להתגבר על מכשול זה, אנו מציעים שחלקיקי LV מגנטיים (MPs) יכולים לעזור בשתי דרכים משלימות.ראשית, ניתן להנחות אותם על ידי מגנט אל משטח דרכי הנשימה כדי לשפר את המיקוד ולעזור לחלקיקי נושאי הגנים להיות באזור הנכון של דרכי הנשימה;ו-ASL) עוברים לשכבת תאים 6. MPs נמצאים בשימוש נרחב ככלי אספקת תרופות ממוקדות כאשר הם נקשרים לנוגדנים, תרופות כימותרפיות או מולקולות קטנות אחרות הנצמדות לממברנות התא או נקשרות לקולטני פני התאים שלהם ומצטברות באתרי הגידול ב נוכחות של חשמל סטטי.שדות מגנטיים לטיפול בסרטן 7. שיטות "היפר-תרמיות" אחרות מכוונות להרוג תאי גידול על ידי חימום חברי פרלמנט כאשר הם נחשפים לשדות מגנטיים מתנודדים.העיקרון של טרנספקציה מגנטית, שבו שדה מגנטי משמש כחומר טרנספקציה כדי לשפר את העברת ה-DNA לתוך תאים, נפוץ בשימוש במבחנה תוך שימוש במגוון של וקטורי גנים לא ויראליים ונגיפים לשורות תאים שקשה לבצע התמרה ..היעילות של LV magnetotransfection עם אספקת LV MP במבחנה לתוך שורת תאים של אפיתל הסימפונות האנושי בנוכחות שדה מגנטי סטטי נקבעה, מה שהגדיל את יעילות ההמרה פי 186 בהשוואה לוקטור LV בלבד.LV MT יושם גם במודל חוץ-גופני של סיסטיק פיברוזיס, שבו טרנספקציה מגנטית הגדילה את התמרה של LV בתרביות ממשק אוויר-נוזל בפקטור של 20 בנוכחות כיח סיסטיק פיברוזיס10.עם זאת, מגנטו-טרנספקציה של איברים in vivo זכתה לתשומת לב מועטה יחסית והיא הוערכה רק במחקרים ספורים בבעלי חיים11,12,13,14,15, במיוחד בריאות16,17.עם זאת, האפשרויות של טרנספקציה מגנטית בטיפול בריאות בסיסטיק פיברוזיס ברורות.Tan et al.(2020) קבע כי "מחקר אימות על אספקה ​​ריאתית יעילה של ננו-חלקיקים מגנטיים יסלול את הדרך לאסטרטגיות עתידיות של שאיפת CFTR לשיפור התוצאות הקליניות בחולים עם סיסטיק פיברוזיס"6.
קשה לדמיין ולחקור את התנהגותם של חלקיקים מגנטיים קטנים על פני דרכי הנשימה בנוכחות שדה מגנטי מופעל, ולכן הם אינם מובנים היטב.במחקרים אחרים, פיתחנו שיטת Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) להדמיה לא פולשנית וכימות של שינויים זעירים in vivo בעומק ASL18 ובהתנהגות MCT19,20 למדידה ישירה של הידרציה על פני תעלת הגז. ומשמש כמדד מוקדם ליעילות הטיפול.בנוסף, שיטת ניקוד ה-MCT שלנו משתמשת בחלקיקים בקוטר 10-35 מיקרומטר המורכבים מאלומינה או זכוכית עם אינדקס שבירה גבוה כסמני MCT הנראים עם PB-PCXI21.שתי השיטות מתאימות להדמיה של מגוון סוגי חלקיקים, כולל MPs.
בשל הרזולוציה המרחבית והזמנית הגבוהה, מבחני ASL ו-MCT מבוססי PB-PCXI שלנו מתאימים היטב לחקור את הדינמיקה ודפוסי ההתנהגות של חלקיקים בודדים ותפזורת in vivo כדי לעזור לנו להבין ולייעל שיטות מסירת גנים MP.הגישה בה אנו משתמשים כאן מבוססת על מחקרים שלנו באמצעות קו הקרן SPring-8 BL20B2, שבו דמיינו תנועת נוזלים לאחר מסירה של מנה של וקטור דמה לדרכי הנשימה האף והריאה של עכברים כדי לעזור להסביר את דפוסי ביטוי הגנים ההטרוגניים שלנו שנצפו בגן שלנו.מחקרים בבעלי חיים עם מינון נשא של 3.4.
מטרת מחקר זה הייתה להשתמש בסינכרוטרון PB-PCXI כדי לדמיין תנועות in vivo של סדרה של חברי פרלמנט בקנה הנשימה של חולדות חיות.מחקרי הדמיה PB-PCXI אלה נועדו לבדוק את סדרת MP, חוזק השדה המגנטי והמיקום כדי לקבוע את השפעתם על תנועת MP.הנחנו ששדה מגנטי חיצוני יעזור ל-MF שנמסר להישאר או לעבור לאזור המטרה.מחקרים אלו גם אפשרו לנו לקבוע תצורות מגנטים הממקסמות את כמות החלקיקים שנותרו בקנה הנשימה לאחר השקיעה.בסדרה שנייה של מחקרים, שאפנו להשתמש בתצורה האופטימלית הזו כדי להדגים את דפוס ההמרה הנובע ממסירה in vivo של LV-MPs לדרכי הנשימה של חולדה, בהנחה שתגרום מסירה של LV-MPs בהקשר של מיקוד בדרכי הנשימה. ביעילות המרת LV מוגברת..
כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת אדלייד (M-2019-060 ו-M-2020-022) וועדת האתיקה לבעלי חיים SPring-8 Synchrotron.הניסויים בוצעו בהתאם להמלצות של ARRIVE.
כל תמונות הרנטגן צולמו בקו הקרן BL20XU בסינכרוטרון SPring-8 ביפן באמצעות הגדרה דומה לזו שתוארה קודם לכן21,22.בקצרה, קופסת הניסוי הייתה ממוקמת 245 מ' מטבעת האחסון של הסינכרוטרון.מרחק דגימה לגלאי של 0.6 מ' משמש למחקרי הדמיית חלקיקים ו-0.3 מ' למחקרי הדמיה in vivo ליצירת השפעות ניגודיות פאזה.נעשה שימוש בקרן מונוכרומטית באנרגיה של 25 keV.התמונות נרכשו באמצעות מתמר רנטגן ברזולוציה גבוהה (SPring-8 BM3) מחובר לגלאי sCMOS.המתמר ממיר קרני רנטגן לאור נראה באמצעות ניצוץ בעובי 10 מיקרומטר (Gd3Al2Ga3O12), אשר מופנה לאחר מכן לחיישן sCMOS באמצעות מטרת מיקרוסקופ ×10 (NA 0.3).גלאי ה-sCMOS היה Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, יפן) עם גודל מערך של 2048 × 2048 פיקסלים וגודל פיקסלים גולמי של 6.5 × 6.5 מיקרומטר.הגדרה זו מעניקה גודל פיקסל איזוטרופי יעיל של 0.51 מיקרומטר ושדה ראייה של כ-1.1 מ"מ × 1.1 מ"מ.משך החשיפה של 100 אלפיות השנייה נבחר כדי למקסם את יחס האות לרעש של חלקיקים מגנטיים בתוך ומחוץ לדרכי הנשימה תוך מזעור חפצי תנועה הנגרמים על ידי נשימה.עבור מחקרים in vivo, תריס רנטגן מהיר הוצב בנתיב הרנטגן כדי להגביל את מינון הקרינה על ידי חסימת קרן הרנטגן בין חשיפות.
מדיית LV לא הייתה בשימוש באף מחקרי הדמיה SPring-8 PB-PCXI מכיוון שתא ההדמיה BL20XU אינו מאושר ביו-בטיחות ברמה 2.במקום זאת, בחרנו מגוון חברי פרלמנט מאופיינים היטב משני ספקים מסחריים המכסים מגוון של גדלים, חומרים, ריכוזי ברזל ויישומים, - תחילה על מנת להבין כיצד שדות מגנטיים משפיעים על תנועת חברי פרלמנט בנימי זכוכית, ולאחר מכן ב דרכי אוויר חיים.משטח.גודל ה-MP משתנה בין 0.25 ל-18 מיקרומטר והוא עשוי מחומרים שונים (ראה טבלה 1), אך ההרכב של כל דגימה, כולל גודל החלקיקים המגנטיים ב-MP, אינו ידוע.בהתבסס על מחקרי ה-MCT הנרחבים שלנו 19, 20, 21, 23, 24, אנו מצפים שניתן לראות חברי MP עד 5 מיקרומטר על משטח דרכי הנשימה של קנה הנשימה, למשל, על ידי הפחתת מסגרות עוקבות כדי לראות נראות משופרת של תנועת MP.MP יחיד של 0.25 מיקרומטר קטן יותר מהרזולוציה של מכשיר ההדמיה, אך PB-PCXI צפוי לזהות את הניגודיות הנפחית שלהם ואת תנועת הנוזל המשטח עליו הם מופקדים לאחר שהופקדו.
דוגמאות לכל MP בטבלה.1 הוכן בנימי זכוכית של 20 μl (Drummond Microcaps, PA, ארה"ב) בקוטר פנימי של 0.63 מ"מ.חלקיקי גוף זמינים במים, בעוד שחלקיקי CombiMag זמינים בנוזל הקנייני של היצרן.כל צינור ממולא למחצה בנוזל (כ-11 μl) וממוקם על מחזיק הדגימה (ראה איור 1).נימי הזכוכית הונחו אופקית על הבמה בתא ההדמיה, בהתאמה, והוצבו בקצוות הנוזל.מגנט קליפת ניקל בקוטר 19 מ"מ (אורך 28 מ"מ) עשוי אדמה נדירה, ניאודימיום, ברזל ובור (NdFeB) (N35, מס' קטלוגי LM1652, Jaycar Electronics, אוסטרליה) עם רזולוציה של 1.17 T הוצמד ל- טבלת העברה נפרדת להשגה שנה מרחוק את המיקום שלך במהלך העיבוד.צילום רנטגן מתחיל כאשר המגנט ממוקם כ-30 מ"מ מעל הדגימה והתמונות נרכשות במהירות של 4 פריימים לשנייה.במהלך ההדמיה, המגנט הובא קרוב לצינור נימי הזכוכית (במרחק של כ-1 מ"מ) ולאחר מכן הועבר לאורך הצינור כדי להעריך את השפעת חוזק השדה והמיקום.
מערך הדמיה במבחנה המכילה דגימות MP בנימי זכוכית בשלב התרגום של דגימת ה-xy.הנתיב של קרן הרנטגן מסומן בקו מקווקו אדום.
לאחר שנקבעה הנראות במבחנה של חברי פרלמנט, תת-קבוצה שלהם נבדקה in vivo על חולדות נקבות Wistar לבקנים (~12 שבועות, ~200 גרם).Medetomidine 0.24 מ"ג/ק"ג (Domitor®, Zenoaq, יפן), midazolam 3.2 מ"ג/ק"ג (Dormicum®, Astellas Pharma, יפן) ובוטרפנול 4 מ"ג/ק"ג (Vetorphale®, Meiji Seika).חולדות הורדמו בתערובת פארמה (יפן) בהזרקה תוך צפקית.לאחר ההרדמה, הם הוכנו להדמיה על ידי הסרת הפרווה מסביב לקנה הנשימה, החדרת צינור אנדוטרכיאלי (ET; צינורית תוך ורידי 16 Ga, Terumo BCT) והתקעתם בשכיבה על צלחת הדמיה מותאמת אישית המכילה שקית תרמית. כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.22. לוחית ההדמיה הוצמדה לאחר מכן לשלב הדגימה בקופסת ההדמיה בזווית קלה כדי ליישר את קנה הנשימה אופקית על תמונת הרנטגן כפי שמוצג באיור 2a.
(א) הגדרת הדמיה In vivo ביחידת ההדמיה SPring-8, נתיב קרן רנטגן מסומן בקו מקווקו אדום.(ב, ג) לוקליזציה של מגנט קנה הנשימה בוצע מרחוק באמצעות שתי מצלמות IP המותקנות אורתוגונלית.בצד שמאל של התמונה על המסך, אתה יכול לראות את לולאת החוט המחזיקה את הראש ואת צינורית האספקה ​​המותקנת בתוך צינור ה-ET.
מערכת משאבת מזרקים נשלטת מרחוק (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) באמצעות מזרק זכוכית 100 µl חוברה לצינור PE10 (0.61 מ"מ OD, 0.28 מ"מ מזהה) באמצעות מחט 30 Ga.סמן את הצינור כדי להבטיח שהקצה נמצא במיקום הנכון בקנה הנשימה בעת הכנסת הצינור האנדוטרכיאלי.באמצעות מיקרו-משאבה, בוכנת המזרק הוסרה וקצה הצינור הוטבל בדגימת MP למסירה.לאחר מכן הוחדר צינור האספקה ​​הטעון לתוך הצינור האנדוטרכיאלי, והצב את הקצה בחלק החזק ביותר של השדה המגנטי המיושם הצפוי שלנו.רכישת התמונה נשלטה באמצעות גלאי נשימה המחובר לתיבת התזמון שלנו מבוססת ארדואינו, וכל האותות (למשל, טמפרטורה, נשימה, פתיחה/סגירה של תריס ורכישת תמונה) תועדו באמצעות Powerlab ו- LabChart (AD Instruments, סידני, אוסטרליה) 22 בעת הדמיה כאשר המארז לא היה זמין, שתי מצלמות IP (Panasonic BB-SC382) הוצבו בכ-90° זו לזו ושימשו לשלוט במיקום המגנט ביחס לקנה הנשימה במהלך ההדמיה (איור 2b, c).כדי למזער חפצי תנועה, תמונה אחת לכל נשימה נרכשה במהלך רמת זרימת הנשימה הסופנית.
המגנט מחובר לשלב השני, שעשוי להיות ממוקם מרחוק בצד החיצוני של גוף ההדמיה.מיקומים ותצורות שונות של המגנט נבדקו, כולל: ממוקם בזווית של כ-30 מעלות מעל קנה הנשימה (תצורות מוצגות באיורים 2a ו-3a);מגנט אחד מעל החיה והשני מתחת, כשהקטבים מוגדרים למשיכה (איור 3ב)., מגנט אחד מעל החיה ואחד מתחת, כאשר הקטבים מוגדרים לדחייה (איור 3c), ומגנט אחד מעל ומאונך לקנה הנשימה (איור 3d).לאחר הגדרת החיה והמגנט וטעינת ה-MP הנבדק לתוך משאבת המזרק, יש לספק מינון של 50 μl בקצב של 4 μl/שנייה עם רכישת התמונות.לאחר מכן המגנט מוזז קדימה ואחורה לאורך או לרוחב קנה הנשימה תוך המשך רכישת תמונות.
תצורת מגנט להדמיה in vivo (א) מגנט אחד מעל קנה הנשימה בזווית של כ-30°, (ב) שני מגנטים המוגדרים למשיכה, (ג) שני מגנטים מוגדרים לדחייה, (ד) מגנט אחד מעל ומאונך ל- קנה הנשימה.הצופה הביט מטה מהפה אל הריאות דרך קנה הנשימה וקרן הרנטגן עברה דרך הצד השמאלי של החולדה ויצאה מהצד הימני.המגנט מועבר לאורך דרכי הנשימה או שמאלה וימינה מעל קנה הנשימה בכיוון קרן הרנטגן.
כמו כן, ביקשנו לקבוע את הנראות וההתנהגות של חלקיקים בדרכי הנשימה בהיעדר ערבוב של נשימה וקצב לב.לכן, בתום תקופת ההדמיה, בעלי חיים הומתמו באופן אנושי עקב מנת יתר של פנטוברביטל (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, ארה"ב; ~65 מ"ג/ק"ג ip).כמה בעלי חיים הושארו על פלטפורמת ההדמיה, ולאחר הפסקת הנשימה ודפיקות הלב, תהליך ההדמיה חזר על עצמו, תוך הוספת מנה נוספת של MP אם לא נראה MP על פני דרכי הנשימה.
התמונות שהתקבלו תוקנו לשדה שטוח וחשוך ואז הורכבו לסרט (20 פריימים לשנייה; 15-25 × מהירות רגילה בהתאם לקצב הנשימה) באמצעות סקריפט מותאם אישית שנכתב ב-MATLAB (R2020a, The Mathworks).
כל המחקרים על מסירת וקטור גנים של LV נערכו במרכז לחקר בעלי חיים במעבדה של אוניברסיטת אדלייד ונועדו להשתמש בתוצאות של ניסוי SPring-8 כדי להעריך אם מסירת LV-MP בנוכחות שדה מגנטי יכולה לשפר את העברת הגנים in vivo .כדי להעריך את ההשפעות של MF ושדה מגנטי, טופלו שתי קבוצות של בעלי חיים: לקבוצה אחת הוזרק LV MF עם מיקום מגנט, ולקבוצה השנייה הוזרק קבוצת ביקורת עם LV MF ללא מגנט.
וקטורי גן LV נוצרו באמצעות שיטות שתוארו בעבר 25, 26.וקטור ה-LacZ מבטא גן גרעיני מקומי בטא-גלקטוזידאז המונע על ידי הפרומוטור המכונן MPSV (LV-LacZ), אשר מייצר תוצר תגובה כחול בתאים שעברו התמרה, הנראה בחזיתות ובחלקים של רקמת הריאה.טיטרציה בוצעה בתרביות תאים על ידי ספירה ידנית של מספר התאים החיוביים ל-LacZ באמצעות hemocytometer כדי לחשב את הטיטר ב-TU/ml.נשאים נשמרים בהקפאה ב-80 מעלות צלזיוס, מופשרים לפני השימוש ונקשרים ל-CombiMag על ידי ערבוב 1:1 ודגירה על קרח לפחות 30 דקות לפני הלידה.
חולדות Sprague Dawley רגילות (n = 3/קבוצה, ~2-3 ip מורדמים עם תערובת של 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, אוסטרליה) ו-60mg/kg ketamine (Ilium, אוסטרליה) בגיל חודש אחד) ip ) הזרקה וצינורית פה ללא ניתוח עם צינורית תוך ורידי 16 Ga.כדי להבטיח שרקמת דרכי הנשימה תקבל התמרה של LV, היא נותנתה באמצעות פרוטוקול ההפרעות המכאניות שתוארו קודם לכן, שבו משטח דרכי הנשימה של קנה הנשימה נשפשף בצורה צירית עם סל תיל (N-Circle, מחלץ אבן ניטינול ללא קצה NTSE-022115) -UDH, קוק מדיקל, ארה"ב) 30 p28.לאחר מכן, כ-10 דקות לאחר ההפרעה בארון הבטיחות הביולוגי, בוצע מתן LV-MP בקנה הנשימה.
השדה המגנטי בשימוש בניסוי זה הוגדר באופן דומה למחקר בקרני רנטגן in vivo, כאשר אותם מגנטים מוחזקים על קנה הנשימה עם מלחצי סטנט זיקוק (איור 4).נפח 50 μl (2 x 25 μl aliquots) של LV-MP נמסר לקנה הנשימה (n = 3 בעלי חיים) באמצעות פיפטה בעלת קצה ג'ל כפי שתואר קודם לכן.קבוצת הביקורת (n = 3 חיות) קיבלה את אותו LV-MP ללא שימוש במגנט.לאחר השלמת העירוי, מוציאים את הצינורית מהצינור האנדוטרכיאלי ומוציאים את החיה.המגנט נשאר במקומו למשך 10 דקות לפני הסרתו.לחולדות קיבלו מינון תת עורי של מלוקסיקאם (1 מ"ל/ק"ג) (איליום, אוסטרליה) ולאחר מכן הפסקת הרדמה על ידי הזרקה תוך צפקית של 1 מ"ג/ק"ג אטיפמזול הידרוכלוריד (Antisedan, Zoetis, אוסטרליה).חולדות נשמרו חמות ונצפו עד להחלמה מלאה מההרדמה.
מכשיר משלוח LV-MP בארון בטיחות ביולוגי.ניתן לראות ששרוול Luer-lock האפור בהיר של צינור ה-ET בולט מהפה, וקצה פיפטת הג'ל המוצג באיור מוחדר דרך צינור ה-ET עד לעומק הרצוי לקנה הנשימה.
שבוע לאחר הליך הניהול של LV-MP, בעלי חיים הוקרבו באופן אנושי על ידי שאיפה של 100% CO2 וביטוי LacZ הוערך באמצעות טיפול X-gal הסטנדרטי שלנו.שלוש טבעות הסחוס הזנביות ביותר הוסרו כדי להבטיח שכל נזק מכני או אצירת נוזלים עקב מיקום צינור אנדוטרכיאלי לא ייכלל בניתוח.כל קנה הנשימה נחתך לאורך כדי לקבל שני חצאים לניתוח והונח בכוס המכילה גומי סיליקון (Sylgard, Dow Inc) באמצעות מחט Minutien (Fine Science Tools) כדי לדמיין את פני השטח הלומינליים.ההפצה והאופי של התאים המתמרדים אושרו על ידי צילום חזיתי באמצעות מיקרוסקופ ניקון (SMZ1500) עם מצלמת DigiLite ותוכנת TCapture (Tucsen Photonics, סין).התמונות נרכשו בהגדלה של פי 20 (כולל ההגדרה המקסימלית לרוחב המלא של קנה הנשימה), כאשר כל אורך קנה הנשימה מוצג שלב אחר שלב, מה שמספק מספיק חפיפה בין כל תמונה כדי לאפשר "לתפור" תמונות.התמונות מכל קנה הנשימה שולבו לאחר מכן לתמונה מורכבת אחת באמצעות Composite Image Editor גרסה 2.0.3 (Microsoft Research) באמצעות אלגוריתם התנועה המישורית. האזור של ביטוי LacZ בתוך התמונות המרוכבות של קנה הנשימה מכל חיה נכמת באמצעות סקריפט MATLAB אוטומטי (R2020a, MathWorks) כפי שתואר בעבר28, תוך שימוש בהגדרות של 0.35 < גוון < 0.58, רוויה > 0.15 וערך < 0.7. אזור הביטוי של LacZ בתוך התמונות המרוכבות של קנה הנשימה מכל חיה נכמת באמצעות סקריפט MATLAB אוטומטי (R2020a, MathWorks) כפי שתואר קודם לכן28, תוך שימוש בהגדרות של 0.35 < גוון < 0.58, רוויה > 0.15 וערך < 0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. האזור של ביטוי LacZ בתמונות קנה הנשימה מורכבות מכל חיה כמת באמצעות סקריפט MATLAB אוטומטי (R2020a, MathWorks) כפי שתואר קודם לכן28 תוך שימוש בהגדרות של 0.350.15 וערך <0.7.如 前所 述 ， 使用 自动 matlab 脚本 （R2020a ， מתמטיקה mtorks） 对 来自 每 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 lacz 表达 区域 进行 量化 ， 使用 0.35 <色调 <0.58 、 饱和度> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。。。。。。。。 和值 <0.如 前所 述 ， 自动 自动 matlab 脚本 （≠ r2020a ， מתמטיקה mtork .................... ירך Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . אזורים של ביטוי LacZ בתמונות מורכבות של קנה הנשימה של כל חיה כומתו באמצעות סקריפט MATLAB אוטומטי (R2020a, MathWorks) כפי שתואר קודם לכן באמצעות הגדרות של 0.35 < גוון < 0.58, רוויה > 0.15 וערך < 0.7.על ידי מעקב אחר קווי המתאר של הרקמה ב-GIMP v2.10.24, נוצרה ידנית מסכה עבור כל תמונה מורכבת כדי לזהות את אזור הרקמה ולמנוע כל זיהוי שווא מחוץ לרקמת קנה הנשימה.האזורים המוכתמים מכל התמונות המרוכבות מכל חיה סוכמו כדי לתת את השטח המוכתם הכולל עבור אותה חיה.לאחר מכן, השטח הצבוע חולק בשטח הכולל של המסכה כדי לקבל אזור מנורמל.
כל קנה הנשימה הוטבע בפרפין וחתך בעובי של 5 מיקרומטר.החתכים נצבעו באדום מהיר ניטרלי למשך 5 דקות ותמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ Nikon Eclipse E400, מצלמת DS-Fi3 ותוכנת לכידת אלמנטים של NIS (גרסה 5.20.00).
כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו ב-GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).מובהקות סטטיסטית נקבעה ל-p ≤ 0.05.התקינות נבדקה באמצעות מבחן Shapiro-Wilk וההבדלים בצביעה של LacZ הוערכו באמצעות מבחן t לא מזווג.
ששת ה-MP המתוארים בטבלה 1 נבדקו על ידי PCXI, והראות מתוארת בטבלה 2. שני MPs פוליסטירן (MP1 ו-MP2; 18 מיקרומטר ו-0.25 מיקרומטר, בהתאמה) לא נראו על ידי PCXI, אך ניתן היה לזהות את הדגימות הנותרות (דוגמאות מוצגות באיור 5).MP3 ו-MP4 נראים חלש (10-15% Fe3O4; 0.25 מיקרומטר ו-0.9 מיקרומטר, בהתאמה).למרות ש-MP5 (98% Fe3O4; 0.25 מיקרומטר) הכיל חלק מהחלקיקים הקטנים ביותר שנבדקו, הוא היה הבולט ביותר.קשה להבחין במוצר CombiMag MP6.בכל המקרים, היכולת שלנו לזהות MFs השתפרה מאוד על ידי הזזת המגנט קדימה ואחורה במקביל לנימים.ככל שהמגנטים התרחקו מהנימי, החלקיקים נשלפו בשרשראות ארוכות, אך ככל שהמגנטים התקרבו ועוצמת השדה המגנטי גדלה, שרשראות החלקיקים התקצרו ככל שהחלקיקים נדדו לעבר המשטח העליון של הנימים (ראה סרטון משלים S1 : MP4), הגדלת צפיפות החלקיקים על פני השטח.לעומת זאת, כאשר המגנט מוסר מהנימי, עוצמת השדה פוחתת וה-MPs מתארגנים מחדש לשרשראות ארוכות המשתרעות מהמשטח העליון של הנימים (ראה סרטון משלים S2: MP4).לאחר שהמגנט מפסיק לנוע, החלקיקים ממשיכים לנוע במשך זמן מה לאחר שהגיעו למצב שיווי המשקל.כשה-MP נע לכיוון והרחק מהמשטח העליון של הנימים, החלקיקים המגנטיים נוטים למשוך פסולת דרך הנוזל.
הנראות של MP תחת PCXI משתנה במידה ניכרת בין הדגימות.(א) MP3, (ב) MP4, (ג) MP5 ו-(ד) MP6.כל התמונות המוצגות כאן צולמו עם מגנט הממוקם כ-10 מ"מ ישירות מעל הנימים.העיגולים הגדולים לכאורה הם בועות אוויר הכלואות בנימים, המראות בבירור את תכונות הקצה השחור והלבן של תמונת ניגודיות הפאזה.התיבה האדומה מציינת את ההגדלה המגבירה את הניגודיות.שים לב שהקטרים ​​של מעגלי המגנט בכל האיורים אינם בקנה מידה והם גדולים פי 100 בערך מהמוצג.
כאשר המגנט נע ימינה ושמאלה לאורך החלק העליון של הנימים, זווית מיתר MP משתנה כדי ליישר קו עם המגנט (ראה איור 6), ובכך מתווה את קווי השדה המגנטי.עבור MP3-5, לאחר שהאקורד מגיע לזווית הסף, החלקיקים נגררים לאורך המשטח העליון של הנימים.לעתים קרובות זה גורם לכך שחברי פרלמנט מתקבצים לקבוצות גדולות יותר ליד המקום שבו השדה המגנטי החזק ביותר (ראה סרטון משלים S3: MP5).הדבר בולט במיוחד גם בעת צילום קרוב לקצה הנימים, מה שגורם ל-MP להצטבר ולהתרכז בממשק נוזל-אוויר.החלקיקים ב-MP6, שהיה קשה יותר להבחין בהם מאלה ב-MP3-5, לא נגררו כשהמגנט נע לאורך הנימים, אבל מיתרי ה-MP התנתקו, והותירו את החלקיקים לעין (ראה סרטון משלים S4: MP6).במקרים מסוימים, כאשר השדה המגנטי המופעל הופחת על ידי הזזת המגנט למרחק רב מאתר ההדמיה, כל חברי הפרלמנט שנותרו ירדו באיטיות אל המשטח התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה, ונשארו במיתר (ראה סרטון משלים S5: MP3) .
הזווית של מיתר MP משתנה כאשר המגנט נע ימינה מעל הנימים.(א) MP3, (ב) MP4, (ג) MP5 ו-(ד) MP6.התיבה האדומה מציינת את ההגדלה המגבירה את הניגודיות.שימו לב שהסרטונים הנוספים מיועדים למטרות אינפורמטיביות מכיוון שהם חושפים מבנה חלקיקים חשוב ומידע דינמי שלא ניתן להמחיש בתמונות סטטיות אלו.
הבדיקות שלנו הראו שהזזת המגנט קדימה ואחורה באיטיות לאורך קנה הנשימה מקלה על הדמיה של ה-MF בהקשר של תנועה מורכבת in vivo.לא בוצעו בדיקות in vivo מכיוון שחרוזי הפוליסטירן (MP1 ו-MP2) לא נראו בנימים.כל אחד מארבעת ה-MF הנותרים נבדק in vivo כאשר הציר הארוך של המגנט ממוקם מעל קנה הנשימה בזווית של כ-30 מעלות לאנך (ראה איורים 2b ו-3a), מכיוון שהדבר הביא לשרשראות MF ארוכות יותר והיה יעיל יותר. מאשר מגנט..התצורה הופסקה.MP3, MP4 ו-MP6 לא נמצאו בקנה הנשימה של בעלי חיים חיים כלשהם.כאשר הדמיינו את דרכי הנשימה של חולדות לאחר הרג אנושי של החיות, החלקיקים נותרו בלתי נראים גם כאשר נפח נוסף נוסף באמצעות משאבת מזרק.MP5 היה בעל תכולת תחמוצת הברזל הגבוהה ביותר והיה החלקיק היחיד הנראה לעין, ולכן הוא שימש להערכת ואפיון התנהגות MP in vivo.
מיקום המגנט מעל קנה הנשימה במהלך החדרת MF הביא לכך שרבים, אך לא כולם, התרכזו בשדה הראייה.כניסת קנה הנשימה של חלקיקים נצפית בצורה הטובה ביותר בבעלי חיים שהומתו באופן אנושי.איור 7 וסרטון משלים S6: MP5 מציג לכידה ויישור מגנטי מהיר של חלקיקים על פני השטח של קנה הנשימה הגחון, מה שמצביע על כך שניתן לכוון את חברי הפרלמנט לאזורים הרצויים של קנה הנשימה.בעת חיפוש דיסטלי יותר לאורך קנה הנשימה לאחר מתן MF, נמצאו כמה MFs קרובים יותר לקרינה, מה שמעיד על חוזק שדה מגנטי לא מספיק כדי לאסוף ולהחזיק את כל ה-MFs, מכיוון שהם נמסרו דרך אזור עוצמת השדה המגנטי המקסימלי במהלך מתן הנוזל.תהליך.עם זאת, ריכוזי MP לאחר לידה היו גבוהים יותר סביב אזור התמונה, מה שמצביע על כך שחברי פרלמנט רבים נשארו באזורי דרכי הנשימה שבהם עוצמת השדה המגנטי המופעל היה הגבוה ביותר.
תמונות של (א) לפני ו-(ב) לאחר מסירת MP5 לקנה הנשימה של חולדה שהורדה לאחרונה עם מגנט ממוקם ממש מעל אזור ההדמיה.האזור המתואר ממוקם בין שתי טבעות סחוסיות.יש מעט נוזלים בדרכי הנשימה לפני מתן ה-MP.התיבה האדומה מציינת את ההגדלה המגבירה את הניגודיות.תמונות אלו לקוחות מהסרטון המופיע ב-S6: MP5 Supplementary Video.
הזזת המגנט לאורך קנה הנשימה in vivo הובילה לשינוי בזווית של שרשרת MP על פני דרכי הנשימה, בדומה לזו שנצפה בנימים (ראה איור 8 וסרטון משלים S7: MP5).עם זאת, במחקר שלנו, חברי פרלמנט לא יכלו להיגרר על פני השטח של דרכי נשימה חיות, כפי שעשויים לנימים לעשות.במקרים מסוימים, שרשרת MP מתארכת כשהמגנט זז ימינה ושמאלה.מעניין שמצאנו גם ששרשרת החלקיקים משנה את עומק שכבת פני השטח של הנוזל כאשר המגנט מוזז לאורך קנה הנשימה, ומתרחבת כאשר המגנט מוזז ישירות מעל הראש ושרשרת החלקיקים מסובבת למצב אנכי (ראה סרטון משלים S7).: MP5 בשעה 0:09, ימין למטה).דפוס התנועה האופייני השתנה כאשר המגנט הוזז לרוחב על פני החלק העליון של קנה הנשימה (כלומר, משמאל או ימינה של החיה, ולא לאורך קנה הנשימה).החלקיקים עדיין נראו בבירור במהלך תנועתם, אך כאשר המגנט הוסר מקנה הנשימה, קצות מיתרי החלקיקים נראו גלויים (ראה סרטון משלים S8: MP5, החל מ-0:08).זה תואם את ההתנהגות הנצפית של השדה המגנטי תחת פעולתו של שדה מגנטי מופעל בנימי זכוכית.
תמונות לדוגמה המציגות MP5 בקנה הנשימה של חולדה חיה מורדמת.(א) המגנט משמש לרכישת תמונות מעל ומשמאל לקנה הנשימה, ולאחר מכן (ב) לאחר הזזת המגנט ימינה.התיבה האדומה מציינת את ההגדלה המגבירה את הניגודיות.תמונות אלו הן מהסרטון המופיע בסרטון המשלים של S7: MP5.
כאשר שני הקטבים היו מכוונים בכיוון צפון-דרום מעל ומתחת לקנה הנשימה (כלומר, מושך; איור 3b), מיתרי ה-MP נראו ארוכים יותר והיו ממוקמים על הדופן הצדדית של קנה הנשימה ולא על פני השטח הגבי של הקנה. קנה הנשימה (ראה נספח).וידאו S9:MP5).עם זאת, ריכוזים גבוהים של חלקיקים באתר אחד (כלומר, פני השטח הגבי של קנה הנשימה) לא זוהו לאחר מתן נוזלים באמצעות מכשיר מגנט כפול, המתרחש בדרך כלל עם מכשיר מגנט יחיד.לאחר מכן, כאשר מגנט אחד הוגדר לדחות קטבים מנוגדים (איור 3c), מספר החלקיקים הנראים בשדה הראייה לא גדל לאחר הלידה.הגדרת שתי תצורות המגנטים היא מאתגרת בשל חוזק השדה המגנטי הגבוה המושך או דוחף את המגנטים בהתאמה.לאחר מכן שונה ההגדרה למגנט בודד המקביל לדרכי הנשימה אך עובר דרך דרכי הנשימה בזווית של 90 מעלות כך שקווי הכוח חצו את דופן קנה הנשימה בצורה אורתוגונלית (איור 3ד), כיוון שנועד לקבוע את האפשרות של צבירה של חלקיקים על הקיר הצדי.להיות נצפה.עם זאת, בתצורה זו, לא הייתה תנועת הצטברות MF או תנועת מגנט ניתנת לזיהוי.בהתבסס על כל התוצאות הללו, נבחרה תצורה עם מגנט בודד וכיוון של 30 מעלות למחקרים in vivo של נשאי גנים (איור 3א).
כאשר החיה צולמה מספר פעמים מיד לאחר שהוקרבה באופן אנושי, היעדר תנועת רקמות מפריעה גרם לכך שניתן היה להבחין בקווי חלקיקים עדינים וקצרים יותר בשדה הבין-סחוסי הצלול, "מתנדנדים" בהתאם לתנועת התרגום של המגנט.רואים בבירור את הנוכחות והתנועה של חלקיקי MP6.
הטיטר של LV-LacZ היה 1.8 x 108 IU/mL, ולאחר ערבוב 1:1 עם CombiMag MP (MP6), לבעלי חיים הוזרקו 50 μl של מינון קנה הנשימה של 9 x 107 IU/ml של כלי LV (כלומר 4.5 x 106 TU/עכברוש).).).במחקרים אלה, במקום להזיז את המגנט במהלך הלידה, קיבענו את המגנט במצב אחד כדי לקבוע אם ניתן (א) לשפר את התמרת LV בהשוואה למסירה וקטורית בהיעדר שדה מגנטי, ו-(ב) אם ניתן היה לשפר את נתיב הנשימה. תהיה מרוכז.התאים עוברים התמרה באזורי המטרה המגנטיים של דרכי הנשימה העליונות.
נראה שהנוכחות של מגנטים והשימוש ב-CombiMag בשילוב עם וקטורי LV לא משפיעים לרעה על בריאות בעלי החיים, וכך גם פרוטוקול האספקה ​​הסטנדרטי שלנו של וקטור LV.תמונות חזיתיות של אזור קנה הנשימה הנתון להפרעות מכניות (איור משלים. 1) הראו שלקבוצה שטופלה ב-LV-MP היו רמות גבוהות יותר באופן משמעותי של התמרה בנוכחות מגנט (איור 9a).רק כמות קטנה של צביעת LacZ כחולה הייתה קיימת בקבוצת הביקורת (איור 9b).כימות של אזורים מנורמלים צבועים X-Gal הראה כי מתן LV-MP בנוכחות שדה מגנטי הביא לשיפור של פי 6 בערך (איור 9c).
דוגמה לתמונות מורכבות המציגות התמרה של קנה הנשימה עם LV-MP (א) בנוכחות שדה מגנטי ו-(ב) בהיעדר מגנט.(ג) שיפור מובהק סטטיסטית באזור המנורמל של התמרה של LacZ בקנה הנשימה עם שימוש במגנט (*p = 0.029, t-test, n = 3 לקבוצה, ממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע).
קטעים נייטרליים מהירים בצבע אדום (דוגמה המוצגת באיור משלים. 2) הצביעו על כך שתאים מוכתמים ב-LacZ היו נוכחים באותה דגימה ובאותו מיקום כפי שדווח בעבר.
האתגר המרכזי בטיפול גנטי בדרכי הנשימה נותר לוקליזציה מדויקת של חלקיקי נשאים באזורי עניין והשגת רמה גבוהה של יעילות התמרה בריאה הניידת בנוכחות זרימת אוויר ופינוי ריר פעיל.עבור נשאי LV המיועדים לטיפול במחלות דרכי הנשימה בסיסטיק פיברוזיס, הגדלת זמן השהייה של חלקיקי הנשאים בדרכי הנשימה המוליכות הייתה עד כה מטרה בלתי מושגת.כפי שציינו Castellani וחב', לשימוש בשדות מגנטיים כדי לשפר את ההמרה יש יתרונות על פני שיטות מסירת גנים אחרות כמו אלקטרופורציה מכיוון שהוא יכול לשלב פשטות, חסכון, מסירה מקומית, יעילות מוגברת וזמן דגירה קצר יותר.ואולי מינון נמוך יותר של רכב10.עם זאת, שיקוע והתנהגות in vivo של חלקיקים מגנטיים בדרכי הנשימה בהשפעת כוחות מגנטיים חיצוניים מעולם לא תוארו, ולמעשה היכולת של שיטה זו להגביר את רמות ביטוי הגנים בדרכי הנשימה החיים שלמות לא הוכחה in vivo.
הניסויים במבחנה שלנו בסינכרוטרון PCXI הראו שכל החלקיקים שבדקנו, למעט פוליסטירן MP, נראו במערך ההדמיה שבו השתמשנו.בנוכחות שדה מגנטי, שדות מגנטיים יוצרים מיתרים שאורכם קשור לסוג החלקיקים ולעוצמת השדה המגנטי (כלומר, קרבתו ותנועתו של המגנט).כפי שמוצג באיור 10, המיתרים שאנו רואים נוצרים כאשר כל חלקיק בודד מתמגנט ומשרה שדה מגנטי מקומי משלו.שדות נפרדים אלו גורמים לחלקיקים דומים אחרים להתאסף ולהתחבר לתנועות מיתר קבוצתיות עקב כוחות מקומיים מכוחות המשיכה והדחיה המקומיים של חלקיקים אחרים.
תרשים המראה (א, ב) שרשראות של חלקיקים הנוצרים בתוך נימים מלאי נוזל ו-(ג, ד) קנה הנשימה מלא באוויר.שימו לב שהנימים וקנה הנשימה אינם נמשכים לפי קנה מידה.לוח (א) מכיל גם תיאור של MF המכיל חלקיקי Fe3O4 המסודרים בשרשראות.
כאשר המגנט נע על פני הנימים, זווית מיתר החלקיקים הגיעה לסף הקריטי עבור MP3-5 המכיל Fe3O4, ולאחר מכן מיתר החלקיקים לא נשאר עוד במקומו המקורי, אלא נע לאורך פני השטח למיקום חדש.מַגנֵט.אפקט זה מתרחש ככל הנראה מכיוון שפני השטח של נימי הזכוכית חלקים מספיק כדי לאפשר לתנועה זו להתרחש.מעניין לציין ש-MP6 (CombiMag) לא התנהג כך, אולי בגלל שהחלקיקים היו קטנים יותר, בעלי ציפוי שונה או מטען משטח אחר, או שהנוזל המוביל הקנייני השפיע על יכולתם לנוע.הניגודיות בתמונת החלקיקים של CombiMag חלשה יותר, מה שמרמז על כך שהנוזל והחלקיקים עשויים להיות בעלי אותה צפיפות ולכן אינם יכולים לנוע בקלות אחד לעבר השני.חלקיקים יכולים גם להיתקע אם המגנט זז מהר מדי, מה שמצביע על כך שעוצמת השדה המגנטי לא תמיד יכולה להתגבר על החיכוך בין חלקיקים בנוזל, מה שמרמז שעוצמת השדה המגנטי והמרחק בין המגנט לאזור המטרה לא צריכים להגיע הַפתָעָה.חָשׁוּב.תוצאות אלו גם מצביעות על כך שלמרות שמגנטים יכולים ללכוד מיקרו-חלקיקים רבים הזורמים דרך אזור המטרה, אין זה סביר שניתן לסמוך על מגנטים שיניעו חלקיקי CombiMag לאורך פני קנה הנשימה.לפיכך, הגענו למסקנה שמחקרי LV MF in vivo צריכים להשתמש בשדות מגנטיים סטטיים כדי למקד פיזית לאזורים ספציפיים של עץ דרכי הנשימה.
ברגע שהחלקיקים נמסרים לגוף, קשה לזהות אותם בהקשר של הרקמה הנעה המורכבת של הגוף, אך יכולת הזיהוי שלהם שופרה על ידי הזזת המגנט אופקית על קנה הנשימה כדי "להניע" את מיתרי MP.בעוד שהדמיה בזמן אמת אפשרית, קל יותר להבחין בתנועת חלקיקים לאחר שהחיה נהרגה באופן אנושי.ריכוזי MP היו בדרך כלל הגבוהים ביותר במיקום זה כאשר המגנט היה ממוקם מעל אזור ההדמיה, למרות שחלקיקים מסוימים נמצאו בדרך כלל בהמשך קנה הנשימה.שלא כמו מחקרים במבחנה, לא ניתן לגרור חלקיקים במורד קנה הנשימה על ידי תנועת מגנט.ממצא זה עולה בקנה אחד עם האופן שבו הליחה המכסה את פני קנה הנשימה מעבדת בדרך כלל חלקיקים בשאיפה, לוכדת אותם בריר ובהמשך מנקה אותם באמצעות מנגנון הפינוי הרירי-ציליארי.
שיערנו ששימוש במגנטים מעל ומתחת לקנה הנשימה לצורך משיכה (איור 3b) יכול לגרום לשדה מגנטי אחיד יותר, ולא לשדה מגנטי המרוכז מאוד בנקודה אחת, מה שעלול לגרום לפיזור אחיד יותר של חלקיקים..עם זאת, המחקר המקדים שלנו לא מצא ראיות ברורות התומכות בהשערה זו.באופן דומה, הגדרת זוג מגנטים לדחייה (איור 3c) לא הביאה לשקיעת חלקיקים נוספים באזור התמונה.שני הממצאים הללו מוכיחים כי מערך המגנט הכפול אינו משפר באופן משמעותי את השליטה המקומית בהצבעת MP, וכי קשה לכוונן את הכוחות המגנטיים החזקים שנוצרו, מה שהופך את הגישה הזו לפחות מעשית.באופן דומה, כיוון המגנט מעל ולרוחב קנה הנשימה (איור 3ד) גם לא הגדיל את מספר החלקיקים שנותרו באזור המצולם.ייתכן שחלק מהתצורות החלופיות הללו לא יצליחו מכיוון שהן מביאות להפחתה בעוצמת השדה המגנטי באזור התצהיר.לפיכך, תצורת המגנט הבודד ב-30 מעלות (איור 3א) נחשבת לשיטת הבדיקה הפשוטה והיעילה ביותר in vivo.
מחקר LV-MP הראה שכאשר וקטורי LV שולבו עם CombiMag ונמסרו לאחר שהופרעו פיזית בנוכחות שדה מגנטי, רמות ההמרה עלו משמעותית בקנה הנשימה בהשוואה לבקרות.בהתבסס על מחקרי הדמיית סינכרוטרון ותוצאות LacZ, נראה היה שהשדה המגנטי מסוגל לשמור על ה-LV בקנה הנשימה ולהפחית את מספר החלקיקים הווקטוריים שחדרו מיד לעומק הריאה.שיפורי מיקוד כאלה יכולים להוביל ליעילות גבוהה יותר תוך הפחתת טיטרים שנמסרו, התמרה לא ממוקדת, תופעות לוואי דלקתיות וחיסוניות ועלויות העברת גנים.חשוב לציין, לדברי היצרן, ניתן להשתמש ב-CombiMag בשילוב עם שיטות העברת גנים אחרות, כולל וקטורים ויראליים אחרים (כגון AAV) וחומצות גרעין.