תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
Toxoplasma gondii הוא טפיל פרוטוזואה תוך תאי המווסת את המיקרו-סביבה של המארח הנגוע וידוע כקשור לשכיחות של גידול גידול במוח.במחקר זה, אנו משערים ש-miRNA-21 אקזומלי מזיהום טוקסופלזמה מקדם צמיחת גידול במוח.אופיינו אקסוזומים ממיקרוגליה BV2 הנגועים בטוקסופלזמה והפנמה של תאי גליומה U87 אושרה.פרופילי ביטוי מיקרו-RNA אקזומליים נותחו באמצעות מערכים של microRNA ו-microRNA-21A-5p הקשורים ל-Toxoplasma gondii ולמיון הגידול.כמו כן, חקרנו את רמות ה-mRNA של גנים הקשורים לגידול בתאי גליומה U87 על ידי שינוי רמות miR-21 באקסוזומים והשפעת אקסוזומים על התפשטות תאי גליומה U87 אנושית.באקסוזומים של תאי גליומה מסוג U87 הנגועים ב-Toxoplasma gondii, הביטוי של microRNA-21 מוגבר והפעילות של גנים אנטי-גידוליים (FoxO1, PTEN ו-PDCD4) מופחתת.אקסוזומים שמקורם ב-BV2 הנגועים בטוקסופלזמה מעוררים שגשוג של תאי גליומה U87.אקסוזומים מעוררים צמיחה של תאי U87 במודל של גידול עכבר.אנו מציעים ש-miR-21 אקזומלי מוגבר במיקרוגליה BV2 נגוע בטוקסופלזמה עשוי למלא תפקיד חשוב כמקדם צמיחת תאים בתאי גליומה U87 על ידי הורדת גנים נגד גידולים.
ההערכה היא כי יותר מ-18.1 מיליון מקרים של סרטן מתקדם אובחנו ברחבי העולם בשנת 2018, כאשר כ-297,000 גידולים במערכת העצבים המרכזית מאובחנים מדי שנה (1.6% מכלל הגידולים)1.מחקרים קודמים הראו כי גורמי הסיכון להתפתחות גידולי מוח אנושיים כוללים מוצרים כימיים שונים, היסטוריה משפחתית וקרינה מייננת מציוד טיפולי ואבחון ראש.עם זאת, הסיבה המדויקת לממאירות אלו אינה ידועה.כ-20% מכלל סוגי הסרטן ברחבי העולם נגרמים על ידי גורמים זיהומיים, כולל וירוסים, חיידקים וטפילים3,4.פתוגנים זיהומיים משבשים את המנגנונים הגנטיים של התא המארח, כמו תיקון DNA ומחזור התא, ועלולים להוביל לדלקת כרונית ולפגיעה במערכת החיסון5.
גורמים זיהומיים הקשורים לסרטן אנושי הם הפתוגנים הנגיפיים הנפוצים ביותר, כולל נגיפי פפילומה אנושיים ונגיפי הפטיטיס B ו-C.טפילים יכולים גם למלא תפקיד פוטנציאלי בהתפתחות סרטן אנושי.מספר מיני טפילים, כלומר Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis ו-Hymenolepis nana, היו מעורבים בסוגים שונים של סרטן אנושי 6,7,8.
Toxoplasma gondii הוא פרוטוזואה תוך תאי המווסת את המיקרו-סביבה של תאי מארח נגועים.לפי הערכות, טפיל זה מדביק כ-30% מאוכלוסיית העולם, מה שמעמיד את כל האוכלוסייה בסיכון9,10.Toxoplasma gondii יכול להדביק איברים חיוניים, כולל מערכת העצבים המרכזית (CNS), ולגרום למחלות קשות כגון דלקת קרום המוח ודלקת מוח קטלנית, במיוחד בחולים עם דכאות חיסונית9.עם זאת, Toxoplasma gondii יכול גם לשנות את הסביבה של המארח הנגוע על ידי מווסת צמיחת תאים ותגובות חיסוניות אצל אנשים בעלי יכולת חיסונית, מה שמוביל לשמירה על זיהום כרוני א-סימפטומטי9,11.מעניין לציין שבהתחשב במתאם בין שכיחות T. gondii לבין שכיחות גידולי מוח, כמה דיווחים מראים ששינויים סביבתיים במארח in vivo עקב זיהום כרוני של T. gondii דומים למיקרו-סביבה של הגידול.
אקסוזומים ידועים כמתקשרים בין-תאיים המספקים תוכן ביולוגי, כולל חלבונים וחומצות גרעין, מתאי שכנים16,17.אקסוזומים יכולים להשפיע על תהליכים ביולוגיים הקשורים לגידול כגון אנטי-אפופטוזיס, אנגיוגנזה וגרורות במיקרו-סביבת הגידול.בפרט, miRNAs (miRNAs), RNAs קטנים שאינם מקודדים באורך של כ-22 נוקלאוטידים, הם מווסתים חשובים של גנים לאחר שעתוק השולטים ביותר מ-30% מה-mRNA האנושי באמצעות קומפלקס ההשתקה המושרה על ידי miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii יכול לשבש תהליכים ביולוגיים על ידי שליטה בביטוי מירנה במארחים נגועים.מירנאים מארח מכילים אותות חשובים לוויסות תהליכים ביולוגיים מארח כדי להשיג את אסטרטגיית ההישרדות של הטפיל.לפיכך, חקר השינויים בפרופיל ה-miRNA המארח לאחר הדבקה ב-T. gondii יכול לעזור לנו להבין את האינטראקציה בין המארח ל-T. gondii בצורה ברורה יותר.ואכן, Thirugnanam et al.15 הציע כי T. gondii מקדם קרצינוגנזה במוח על ידי שינוי הביטוי שלו ב-miRNA של מארח ספציפי הקשור לצמיחת גידול ומצא כי T. gondii יכול לגרום לגליומות בחיות ניסוי.
מחקר זה מתמקד בשינוי של miR-21 האקסוזומלי במיקרוגליה מארח הנגועה ב- Toxoplasma BV2.ראינו תפקיד אפשרי של שינוי ב-miR-21 האקסוזומלי בצמיחת תאי גליומה U87 עקב החזקה בגרעין של FoxO1/p27, שהוא היעד של miR-21 המובע יתר על המידה.
אקסוזומים שמקורם ב-BV2 הושגו באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית ואושרו בשיטות שונות למניעת זיהום ברכיבים תאיים או שלפוחיות אחרות.אלקטרופורזה של ג'ל SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) הראתה דפוסים ברורים בין חלבונים המופקים מתאי BV2 ואקסוזומים (איור 1A), ודגימות הוערכו עבור נוכחות של Alix, אשר נותחה על ידי סופג מערבי של סמני חלבון אקזומליים ב.תיוג אליקס נמצא בחלבוני אקסוזום אך לא בחלבוני תאי BV2 lysate (איור 1B).בנוסף, RNA מטוהר מאקסוזומים שמקורם ב-BV2 נותח באמצעות ביואנליזר.רק לעתים נדירות נצפו תת-יחידות ריבוזומליות של 18S ו-28S בדפוס נדידת ה-RNA האקסוזומלי, דבר המעיד על טוהר אמין (איור 1C).לבסוף, מיקרוסקופיה אלקטרונית העברה הראתה כי האקסוזומים שנצפו היו בגודל של כ-60-150 ננומטר ובעל מבנה דמוי גביע אופייני למורפולוגיה של אקסוזום (איור 1D).
אפיון של אקסוזומים שמקורם בתאי BV2.(א) דף גיליון נתוני בטיחות.חלבונים בודדו מתאי BV2 או אקסוזומים שמקורם ב-BV2.דפוסי חלבון שונים בין תאים ואקסוזומים.(ב) ניתוח כתם מערבי של סמן אקסוזומלי (Alix).(ג) הערכה של RNA מטוהר מתאי BV2 ואקסוזומים שמקורם ב-BV2 באמצעות ביואנליזר.לפיכך, תת-יחידות ריבוזומליות 18S ו-28S בתאי BV2 נמצאו רק לעתים נדירות ב-RNA אקסוזומלי.(ד) מיקרוסקופ אלקטרונים העברה הראתה כי אקסוזומים מבודדים מתאי BV2 נצבעו באופן שלילי ב-2% אורניל אצטט.אקסוזומים הם בגודל של 60-150 ננומטר בקירוב וצורת כוס (Song and Jung, נתונים שלא פורסמו).
הפנמה תאית של אקסוזומים שמקורם ב-BV2 לתוך תאי גליומה אנושיים מסוג U87 נצפתה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.אקסוזומים המסומנים ב-PKH26 ממוקמים בציטופלזמה של תאי U87.גרעינים נצבעו ב-DAPI (איור 2A), המצביע על כך שניתן להפנים אקסוזומים שמקורם ב-BV2 על ידי תאי מארח ולהשפיע על הסביבה של תאי הנמען.
הפנמה של אקסוזומים שמקורם ב-BV2 לתוך תאי גליומה U87 ואקסוזומים שמקורם ב-BV2 הנגועים ב-Toxoplasma RH גרמו לשגשוג של תאי גליומה U87.(א) אקסוזומים נבלעים בתאי U87 שנמדדו במיקרוסקופיה קונפוקלית.תאי גליומה מסוג U87 הודגרו עם אקסוזומים שסומנו ב-PKH26 (אדום) או ללא בקרה למשך 24 שעות.הגרעינים נצבעו ב-DAPI (כחול) ולאחר מכן נצפו תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי (סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר, x 3000).(ב) שגשוג תאי גליומה U87 נקבע על ידי בדיקת שגשוג תאים.תאי גליומה U87 טופלו באקסוזומים למשך הזמן המצוין. *P < 0.05 התקבל במבחן t של הסטודנט. *P < 0.05 התקבל במבחן t של הסטודנט. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0.05 לפי מבחן t של הסטודנט. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 שהושג באמצעות מבחן t של הסטודנט.
לאחר אישור הפנמה של אקסוזומים שמקורם ב-BV2 לתאי גליומה מסוג U87, ביצענו מבחני שגשוג תאים כדי לחקור את תפקידם של אקסוזומים שמקורם ב-BV2 בפיתוח תאי גליומה אנושיים.טיפול בתאי U87 עם אקסוזומים מתאי BV2 הנגועים ב-T. gondii הראה כי אקסוזומים שמקורם ב-T. gondii גרמו לשגשוג גבוה יותר משמעותית של תאי U87 בהשוואה לבקרה (איור 2B).
בנוסף, לצמיחה של תאי U118 היו תוצאות זהות לאלו של U87, שכן אקסוזומים מעוררי Toxoplasma גרמו לרמות הגבוהות ביותר של התפשטות (נתונים לא מוצגים).בהתבסס על נתונים אלה, אנו יכולים להצביע על כך שאקסוזומים הנגועים בטוקסופלזמה שמקורם ב-BV2 ממלאים תפקיד חשוב בשגשוג תאי גליומה.
כדי לחקור את ההשפעה של אקסוזומים נגועים ב-BV2 על התפתחות הגידול, הזרקנו תאי גליומה U87 לעכברים עירומים עבור מודל xenograft והזרקנו אקסוזומים שמקורם ב-BV2 או אקסוזומים שמקורם ב-BV2.לאחר שהתגלו גידולים לאחר שבוע, כל קבוצת ניסוי של 5 עכברים חולקה לפי גודל הגידול כדי לקבוע את אותה נקודת התחלה, וגודל הגידול נמדד במשך 22 ימים.
בעכברים עם מודל הקסנוגרפט U87, גודל ומשקל גידול גדולים משמעותית נצפו בקבוצת האקסוזומים הנגועים ב-BV2 ביום 22 (איור 3A,B).מצד שני, לא היה הבדל משמעותי בגודל הגידול בין קבוצת האקסוזומים שמקורם ב-BV2 לבין קבוצת הביקורת לאחר טיפול באקסוזום.בנוסף, עכברים שהוזרקו עם תאי גליומה ואקסוזומים הציגו חזותית את נפח הגידול הגדול ביותר בקבוצת האקסוזומים שמקורם ב-BV2 הנגועים ב-RH (איור 3C).תוצאות אלו מוכיחות כי אקסוזומים נגועים ב-BV2 נגועים בטוקסופלזמה גורמים לצמיחת גליומה במודל של גידול עכבר.
אונקוגנזה (AC) של אקסוזומים שמקורם ב-BV2 במודל עכבר Xenograft U87.גודל הגידול (A) ומשקל (B) גדלו באופן משמעותי בעכברים עירומים BALB/c שטופלו באקסוזומים נגועים ב-RH שמקורם ב- BV2.עכברים עירומים BALB/c (C) הוזרקו תת עורית עם 1 x 107 תאי U87 שהושעו בתערובת Matrigel.שישה ימים לאחר ההזרקה, 100 מיקרוגרם של אקסוזומים שמקורם ב-BV2 טופלו בעכברים.גודל ומשקל הגידול נמדדו בימים המצוינים ולאחר ההקרבה, בהתאמה. *P < 0.05. *P < 0.05. *Р < 0,05. *P < 0.05. *P < 0.05. *P < 0.05. *Р < 0,05. *P < 0.05.
הנתונים הראו כי 37 miRNAs (16 הובעו יתר על המידה ו-21 הובעו למטה) הקשורים לחסינות או התפתחות גידולים השתנו באופן משמעותי במיקרוגליה לאחר הדבקה בזן Toxoplasma RH (איור 4A).רמות ביטוי יחסיות של miR-21 בקרב miRNAs שהשתנו אושרו על ידי RT-PCR בזמן אמת באקסוזומים שמקורם ב-BV2, אקסוזומים שטופלו בתאי BV2 ו-U87.ביטוי של miR-21 הראה עלייה משמעותית באקסוזומים מתאי BV2 הנגועים ב- Toxoplasma gondii (זן RH) (איור 4B).רמות הביטוי היחסיות של miR-21 בתאי BV2 ו-U87 עלו לאחר קליטה של ​​אקסוזומים שהשתנו (איור 4B).הרמות היחסיות של ביטוי miR-21 ברקמות המוח של חולי גידול ועכברים שנדבקו ב- Toxoplasma gondii (זן ME49) היו גבוהות יותר מאשר בביקורות, בהתאמה (איור 4C).תוצאות אלו מתואמות עם הבדלים בין רמות הביטוי של מיקרו-RNA חזויים ומאושרים במבחנה ובאינבו.
שינויים בביטוי של miP-21a-5p exosomal במיקרוגליה הנגועה ב- Toxoplasma gondii (RH).(א) מדגים שינויים משמעותיים ב-siRNA הקשורים לחסינות או להתפתחות גידול בעקבות זיהום T. gondii RH.(ב) רמות ביטוי יחסי של miR-21 זוהו על ידי RT-PCR בזמן אמת באקסוזומים שמקורם ב-BV2, באקסוזומים שטופלו ב-BV2 ובתאי U87.(ג) רמות ביטוי יחסי של miR-21 נמצאו ברקמות המוח של חולי גידול (N=3) ועכברים שנדבקו ב- Toxoplasma gondii (זן ME49) (N=3). *P < 0.05 התקבל במבחן t של הסטודנט. *P < 0.05 התקבל במבחן t של הסטודנט. *P < 0.05 תוספת של t-критерия Стьюдента. *P < 0.05 התקבל באמצעות מבחן t של Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 שהושג באמצעות מבחן t של הסטודנט.
אקסוזומים מתאי BV2 הנגועים ב-RH הובילו לצמיחה של גליומות in vivo ו-in vitro (איור 2, 3).כדי לזהות mRNA רלוונטיים, בדקנו את רמות ה-mRNA של גנים מטרה נגד גידולים, קופסת המזלג O1 (FoxO1), PTEN ומוות תאי מתוכנת 4 (PDCD4) בתאי U87 נגועים באקסוזומים שמקורם ב-BV2 או RH BV2.ניתוח ביואינפורמטיקה הראה שלכמה גנים הקשורים לגידול, כולל הגנים FoxO1, PTEN ו-PDCD4, יש אתרי קישור של miR-2121,22.רמות mRNA של גנים מטרה נגד גידולים הופחתו באקסוזומים שמקורם ב-BV2 בהשוואה לאקסוזומים שמקורם ב-BV2 (איור 5A).FoxO1 הראה רמות חלבון מופחתות באקסוזומים שמקורם ב-BV2 בהשוואה לאקסוזומים שמקורם ב-BV2 (איור 5B).בהתבסס על תוצאות אלו, נוכל לאשר כי אקסוזומים שמקורם ב-BV2 הנגוע ב-RH מורידים גנים אנטי-אונקוגניים, ושומרים על תפקידם בצמיחת הגידול.
אקסוזומים שמקורם ב-BV2 נגועים ב-Toxoplasma RH מעוררים דיכוי של גנים אנטי-גידולים בתאי גליומה U87 על-ידי אקסוזומים שמקורם ב-BV2 הנגועים ב-Toxoplasma RH.(א) PCR בזמן אמת של ביטוי FoxO1, PTEN ו-PDCD4 באקסוזומים שמקורם ב-T. gondii RH נגוע ב-BV2 בהשוואה לאקסוזומים PBS.β-actin mRNA שימש כבקרה.(ב) ביטוי FoxO1 נקבע על ידי סופג מערבי ונתוני דנסיטומטריה הוערכו סטטיסטית באמצעות תוכנית ImageJ. *P < 0.05 התקבל במבחן t של הסטודנט. *P < 0.05 התקבל במבחן t של הסטודנט. *P < 0.05 תוספת של t-критерия Стьюдента. *P < 0.05 התקבל באמצעות מבחן t של Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 שהושג באמצעות מבחן t של הסטודנט.
כדי להבין את ההשפעה של miP-21 באקסוזומים על ויסות גנים הקשורים לגידול, תאי U87 הועברו עם מעכב של miP-21 באמצעות Lipofectamine 2000 והתאים נקצרו 24 שעות לאחר ההעברה.רמות הביטוי FoxO1 ו-p27 בתאים שעברו טרנספקציה עם מעכבי miR-21 הושוו לתאים שטופלו באקסוזומים שמקורם ב-BV2 באמצעות qRT-PCR (איור 6A,B).טרנספקציה של מעכב miR-21 לתאי U87 הורידה משמעותית את ביטוי FoxO1 ו-p27 (איור 6).
miP-21 שמקורו ב-BV2 הנגוע ב-RH שינה את ביטוי FoxO1/p27 בתאי גליומה U87.תאי U87 הועברו עם מעכב miP-21 באמצעות Lipofectamine 2000 ותאים נקצרו 24 שעות לאחר ההעברה.רמות הביטוי FoxO1 ו-p27 בתאים שעברו טרנספוגציה עם מעכבי miR-21 הושוו לרמות בתאים שטופלו באקסוזומים שמקורם ב-BV2 באמצעות qRT-PCR (A, B).
כדי לברוח מהתגובה החיסונית של המארח, טפיל הטוקסופלזמה הופך לציסטה רקמה.הם טפילים רקמות שונות, כולל המוח, הלב ושריר השלד, לאורך כל חייו של המארח ומווסתים את התגובה החיסונית של המארח.בנוסף, הם יכולים לווסת את מחזור התא ואת האפופטוזיס של תאי מארח, ולקדם את התפשטותם14,24.Toxoplasma gondii מדביק בעיקר תאים דנדריטים מארח, נויטרופילים ושושלת מונוציטים/מקרופאגים, כולל מיקרוגליות במוח.Toxoplasma gondii משרה את ההתמיינות של מקרופאגים של הפנוטיפ M2, משפיעה על ריפוי פצעים לאחר זיהום פתוגן, וכן קשורה להיפר-וסקולריזציה ולפיברוזיס גרנולומטי.פתוגנזה התנהגותית זו של זיהום בטוקסופלזמה עשויה להיות קשורה לסמנים הקשורים להתפתחות הגידול.הסביבה העוינת המווסתת על ידי Toxoplasma עשויה להידמות לקדם הסרטן המקביל.לכן, ניתן להניח שזיהום בטוקסופלזמה אמור לתרום להתפתחות גידולי מוח.למעשה, שיעורים גבוהים של זיהום בטוקסופלזמה דווחו בסרום של חולים עם גידולי מוח שונים.בנוסף, Toxoplasma gondii עשויה להיות גורם מסרטן נוסף ולפעול באופן סינרגטי כדי לעזור למסרטנים זיהומיים אחרים לפתח גידולי מוח.בהקשר זה, ראוי לציין כי P. falciparum ו-Epstein-Barr virus תורמים סינרגטית להיווצרות לימפומה של Burkitt.
תפקידם של אקסוזומים כמווסתים בתחום חקר הסרטן נחקר בהרחבה.עם זאת, תפקידם של אקסוזומים בין טפילים למארחים נגועים עדיין לא מובן.עד כה, מווסתים שונים, כולל חלבונים מופרשים, הסבירו את התהליכים הביולוגיים שבאמצעותם טפילי פרוטוזואה מתנגדים להתקפות המארח ומנציחים זיהום.לאחרונה, גדלה התפיסה לפיה מיקרו-שלפוחיות הקשורות לפרוטוזואים והמיקרו-RNA שלהן מתקשרות עם תאי מארח כדי ליצור סביבה נוחה להישרדותם.לפיכך, נדרשים מחקרים נוספים כדי לגלות את הקשר בין שינויים ב-miRNAs אקזוזומליים לבין התפשטות תאי גליומה.שינוי מיקרו-RNA (צביר גנים miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 ו-miR-17-92) נקשר לקדם STAT3 במקרופאגים אנושיים נגועים בטוקסופלזמה, מווסת ומעורר אנטי -אפופטוזיס בתגובה לזיהום Toxoplasma gondii 29 .זיהום בטוקסופלזמה מגביר את הביטוי של miR-17-5p ו-miR-106b-5p, הקשורים למספר מחלות היפר פרוליפרטיביות 30 .נתונים אלה מצביעים על כך ש-miRNA של מארח המווסת על ידי זיהום בטוקסופלזמה הם מולקולות חשובות להישרדות טפילים ולפתוגנזה בהתנהגות הביולוגית של המארח.
מירנאים משתנים יכולים להשפיע על סוגים שונים של התנהגות במהלך התחלת והתקדמות של תאים ממאירים, כולל גליומות: ספיקה עצמית של אותות גדילה, חוסר רגישות לאותות מעכבי גדילה, התחמקות מאפופטוזיס, פוטנציאל שכפול בלתי מוגבל, אנגיוגנזה, פלישה וגרורות ודלקת.בגליומה, מיRNAs משתנים זוהו במספר מחקרי פרופיל ביטוי.
במחקר הנוכחי, אישרנו רמות גבוהות של ביטוי miRNA-21 בתאי מארח נגועים בטוקסופלזמה.miR-21 זוהה כאחד המיקרו-RNA המבוטא-יתר בתדירות גבוהה בגידולים מוצקים, כולל גליומות, 33 והביטוי שלו מתאם עם דרגת הגליומה.עדויות מצטברות מצביעות על כך ש-miR-21 הוא אונקוגן חדש שפועל כגורם אנטי-אפופטוטי בצמיחת גליומה ובא לידי ביטוי יתר ברקמות ובפלזמה של ממאירות במוח האנושי.באופן מעניין, אי-אקטיבציה של miR-21 בתאי וברקמות גליומה מפעילה את עיכוב התפשטות התאים עקב אפופטוזיס תלוי קספאז.ניתוח ביואינפורמטי של יעדים חזויים של miR-21 גילה מספר גנים מדכאי גידול הקשורים למסלולי אפופטוזיס, כולל מוות תאי מתוכנת 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN ו-Forkhead Box O1 (FoxO1), עם אתר הקישור miR-2121..22.38.
FoxO1, כאחד מגורמי השעתוק (FoxO), מעורב בהתפתחות סוגים שונים של סרטן אנושי ויכול לווסת את הביטוי של גנים מדכאי גידולים כגון p21, p27, Bim ו-FasL40.FoxO1 יכול לקשור ולהפעיל מעכבי מחזור תאים כגון p27 כדי לדכא את צמיחת התאים.יתר על כן, FoxO1 הוא גורם מפתח של איתות PI3K/Akt ומווסת תהליכים ביולוגיים רבים כמו התקדמות מחזור התא והתמיינות תאים באמצעות הפעלה של שעתוק p2742.
לסיכום, אנו מאמינים ש-miR-21 אקזוזומלי שמקורו במיקרוגליה נגועה בטוקסופלזמה עשוי למלא תפקיד חשוב כמווסת צמיחה של תאי גליומה (איור 7).עם זאת, דרושים מחקרים נוספים כדי למצוא קשר ישיר בין miR-21 אקזומלי, זיהום ב-Toxoplasma שונה וגדילת גליומה.תוצאות אלו צפויות לספק נקודת מוצא לחקר הקשר בין זיהום בטוקסופלזמה לבין שכיחות גליומה.
תרשים סכמטי של מנגנון הקרצינוגנזה של גליומה (מוח) מוצע במחקר זה.המחבר מצייר ב-PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
כל הפרוטוקולים הניסויים במחקר זה, כולל השימוש בבעלי חיים, היו בהתאם להנחיות האתיות הסטנדרטיות של האוניברסיטה הלאומית של סיאול לטיפול בבעלי חיים ומשתמשים ואושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית הספר לרפואה של האוניברסיטה הלאומית בסיאול (מספר IRB SNU- 150715).-2).כל ההליכים הניסויים בוצעו בהתאם להמלצות ARRIVE.
תאי מיקרוגליה של עכבר BV2 ותאי גליומה אנושיים U87 תורבו במדיום של Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, קוריאה) ובמדיום של Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), כל אחד מכיל 10% סרום בקר עוברי, 4 mM l- גלוטמין, 0.2 מ"מ פניצילין ו-0.05 מ"מ סטרפטומיצין.תאים תורבו באינקובטור עם 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.קו תאי גליומה אחר, U118, שימש להשוואה עם תאי U87.
כדי לבודד אקסוזומים מזני RH ו-ME49 הנגועים ב-T. gondii, נקצרו T. gondii tachyzoites (זן RH) מחלל הבטן של עכברי BALB/c בני 6 שבועות שהוזרקו 3-4 ימים לפני כן.Tachyzoites נשטפו שלוש פעמים עם PBS וטיהרו על ידי צנטריפוגה ב-40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב)43.כדי להשיג טכיזואיטים של זן ME49, לעכברי BALB/c הוזרקו תוך צפקית עם 20 ציסטות רקמה, והתמרה של טכיזוייט בציסטות נאספה על ידי שטיפת חלל הבטן ביום ה-6-8 לאחר ההדבקה (PI).עכברים שנדבקו ב-PBS.טכיזויטים ME49 גודלו בתאים בתוספת של 100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין (Gibco/BRL, גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב), 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (Gibco/BRL), ו-5% סרום בקר עוברי (Lonza, Walkersville, MD ) .., ארה"ב) ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.לאחר טיפוח בתאי Vero, טכיזויטים ME49 הועברו פעמיים דרך מחט בגודל 25 ולאחר מכן דרך מסנן של 5 מיקרומטר להסרת פסולת ותאים.לאחר הכביסה, הטכיזויטים הושעו מחדש ב-PBS44.ציסטות רקמות של זן Toxoplasma gondii ME49 נשמרו על ידי הזרקה תוך צפקית של ציסטות מבודדות מהמוח של עכברי C57BL/6 נגועים (Orient Bio Animal Center, Seongnam, קוריאה).המוח של עכברים נגועים ב-ME49 נקצר לאחר 3 חודשים של PI ונטחן תחת מיקרוסקופ כדי לבודד ציסטות.העכברים הנגועים הוחזקו בתנאים מיוחדים ללא פתוגנים (SPF) בבית הספר לרפואה של האוניברסיטה הלאומית בסיאול.
סך ה-RNA הופק מאקסוזומים שמקורם ב-BV2, תאי BV2 ורקמות באמצעות ערכת miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, גרמניה) לפי הוראות היצרן, כולל זמן הדגירה לשלב הגלישה.ריכוז ה-RNA נקבע בספקטרופוטומטר NanoDrop 2000.איכותם של מיקרו-מערכי RNA הוערכה באמצעות ניתוח ביולוגי של Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, הולנד).
DMEM עם 10% FBS דל באקסוזום הוכן על ידי אולטרה צנטריפוגה ב-100,000 גרם למשך 16 שעות ב-4 מעלות צלזיוס וסונן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר (Nalgene, Rochester, NY, ארה"ב).תאי BV2, 5 × 105, תורבו ב-DMEM המכיל 10% FBS מדולדל אקזוזום ו-1% אנטיביוטיקה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.לאחר 24 שעות של דגירה, טכיזויטים של זן RH או ME49 (MOI = 10) נוספו לתאים וטפילים לא פולשים הוסרו תוך שעה ומולאו מחדש ב-DMEM.אקסוזומים מתאי BV2 בודדו על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית שונה, השיטה הנפוצה ביותר.השהה מחדש את גלולת האקסוזום ב-300 μl PBS לניתוח RNA או חלבון.הריכוז של אקסוזומים מבודדים נקבע באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA (Pierce, Rockford, IL, ארה"ב) וספקטרופוטומטר NanoDrop 2000.
משקעים מתאי BV2 או אקסוזומים שמקורם ב-BV2 הוסרו בתמיסת מיצוי חלבון PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, קוריאה) וחלבונים הועמסו על גבי ג'לים של Coomassie brilliant blue 10% SDS polyacrylamide.בנוסף, חלבונים הועברו לממברנות PVDF למשך שעתיים.כתם Western אומת באמצעות נוגדן Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ארה"ב) כסמן אקסוזומלי.IgG נגד עכברים של עיזים מצומדות ב-HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, ארה"ב) ומנתח תמונה זוהר LAS-1000 פלוס (Fuji Photographic Film, טוקיו, יפן) שימשו כנוגדן משני..מיקרוסקופ אלקטרונים העברה בוצע כדי לחקור את הגודל והמורפולוגיה של אקסוזומים.אקסוזומים מבודדים מתאי BV2 (6.40 מיקרוגרם/מיקרוגל) הוכנו על רשתות מצופות פחמן והוצבעו באופן שלילי ב-2% אורניל אצטט למשך דקה אחת.הדגימות המוכנות נצפו במתח מואץ של 80 קילו וולט באמצעות JEOL 1200-EX II (טוקיו, יפן) המצויד במצלמת ES1000W Erlangshen CCD (Gatan, Pleasanton, CA, ארה"ב).
אקסוזומים שמקורם ב-BV2 נצבעו באמצעות ערכת קישור פלואורסצנטי אדום PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.תאי U87, 2×105, עם אקסוזומים מסומנים PKH26 (אדום) או ללא אקסוזומים כביקורת שלילית, הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות באינקובטור של 5% CO2.גרעיני תאי U87 נצבעו ב-DAPI (כחול), תאי U87 נקבעו ב-4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן נותחו במערכת מיקרוסקופ קונפוקאלי Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, מנהיים, גרמניה).ניתן לצפייה.
cDNA סונתז מ-siRNA באמצעות סינתזת הגדיל הראשון של Mir-X siRNA וערכת SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, יפן).PCR כמותי בזמן אמת בוצע באמצעות מערכת זיהוי PCR בזמן אמת iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב) באמצעות פריימרים ותבניות מעורבבים עם SYBR Premix.ה-DNA הוגבר במשך 40 מחזורים של דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות וחישול ב-60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות.הנתונים מכל תגובת PCR נותחו באמצעות מודול ניתוח הנתונים של תוכנת המערכת האופטית iQ™5 (Bio-Rad).שינויים יחסיים בביטוי הגנים בין גני מטרה נבחרים לבין β-actin/siRNA (ו-U6) חושבו בשיטת העקומה הסטנדרטית.רצפי הפריימר שבהם נעשה שימוש מוצגים בטבלה 1.
3 x 104 תאי גליומה U87 נזרעו בצלחות עם 96 בארות וערבבו עם אקסוזומים נגועים בטוקסופלזמה שמקורם ב-BV2 (50 מיקרוגרם/מ"ל) או אקסוזומים ללא דופק שמקורם ב-BV2 (50 מיקרוגרם/מ"ל) כביקורות ב-12, 18 ו-36 שעות. .קצב התפשטות התאים נקבע באמצעות ערכת ספירת תאים-8 (Dojindo, Kumamoto, יפן) (איורים משלימים S1-S3) 46.
עכברי BALB/c עירומים בנות 5 שבועות נרכשו מ-Orient Bio (Seongnam-si, דרום קוריאה) והוחזקו בנפרד בכלובים סטריליים בטמפרטורת החדר (22±2 מעלות צלזיוס) ולחות (45±15 מעלות צלזיוס).%) בטמפרטורת החדר (22±2 מעלות צלזיוס) ולחות (45±15%).מחזור אור של 12 שעות ומחזור כהה של 12 שעות בוצעו תחת SPF (מרכז החיות של בית הספר הלאומי לרפואה של האוניברסיטה בסיאול).עכברים חולקו אקראית לשלוש קבוצות של 5 עכברים כל אחת ולכל הקבוצות הוזרקו תת עורית 400 מ"ל של PBS המכילים 1 x 107 תאי גליומה U87 וגורם גדילה מופחת BD Matrigel™ (BD Science, מיאמי, FL, ארה"ב).שישה ימים לאחר הזרקת הגידול, הוזרקו לאתר הגידול 200 מ"ג של אקסוזומים שמקורם בתאי BV2 (עם/בלי זיהום בטוקסופלזמה).22 ימים לאחר ההדבקה בגידול, גודל הגידול של עכברים בכל קבוצה נמדד עם קליפר שלוש פעמים בשבוע, ונפח הגידול חושב לפי הנוסחה: 0.5×(רוחב)×2×אורך.
ניתוח ביטוי של MicroRNA באמצעות מערך miRNA LNA של miRCURYTM, דור 7 כולל מערכי mmu ו-rno (EXIQON, Vedbaek, דנמרק) המכסים 1119 עכברים מאופיינים היטב בין 3100 בדיקות ללכידת miRNA של בני אדם, עכברים וחולדות.במהלך הליך זה, 250 עד 1000 ננוגרם של RNA כולל הוסרו מה-5'-פוספט על ידי טיפול בפוספטאז אלקליין מעי עגל ואחריו תיוג עם צבע פלואורסצנטי ירוק Hy3.הדגימות המסומנות הוכלאו לאחר מכן על ידי טעינת שקופיות מיקרו-מערך באמצעות ערכת תא הכלאה (Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב) וערכת שקופיות הכלאה (Agilent Technologies).הכלאה בוצעה במשך 16 שעות ב-56 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן נשטפו המיקרו-מערכים בהתאם להמלצות היצרן.שקופיות המיקרו-מערך המעובדות נסרקו לאחר מכן באמצעות מערכת סורק מיקרו-מערך Agilent G2565CA (Agilent Technologies).תמונות סרוקות יובאו באמצעות תוכנת Agilent Feature Extraction גרסה 10.7.3.1 (Agilent Technologies) ועוצמת הקרינה של כל תמונה כמתה באמצעות קובץ GAL המתאים של פרוטוקול Exiqon שהשתנה.נתוני מיקרו-מערכים עבור המחקר הנוכחי מופקדים במסד הנתונים GEO תחת מספר ההצטרפות GPL32397.
פרופילי ביטוי של miRNAs אקסזומליים בוגרים במיקרוגליה של זני RH או ME49 הנגועים בטוקסופלזמה נותחו באמצעות כלי רשת שונים.miRNAs הקשורים להתפתחות גידול זוהו באמצעות miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) וסוננו עם עוצמת אות מנורמלת (log2) גדולה מ-8.0.בין miRNAs, נמצאו miRNAs בעלי ביטוי דיפרנציאלי השתנו יותר מפי 1.5 על ידי ניתוח מסנן של miRNAs שהשתנו על ידי זני RH או ME49 נגועים ב-T. gondii.
תאים נזרעו בצלחות שש בארות (3 x 105 תאים/באר) ב-opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, ארה"ב) באמצעות Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ארה"ב).התאים שעברו תרבית תורבו במשך 6 שעות ולאחר מכן הוחלף המדיום למדיום שלם טרי.תאים נקצרו 24 שעות לאחר ההעברה.
ניתוח סטטיסטי בוצע בעיקר באמצעות מבחן t של Student עם תוכנת אקסל (מיקרוסופט, וושינגטון די.סי., ארה"ב).לניתוח בעלי חיים ניסויים, ANOVA דו כיווני בוצע באמצעות תוכנת Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, ארה"ב). ערכי P < 0.05 נחשבו כמובהקים סטטיסטית. ערכי P < 0.05 נחשבו כמובהקים סטטיסטית. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. ערכי P <0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. ערכי P <0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית.
כל הפרוטוקולים הניסויים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית הספר לרפואה של האוניברסיטה הלאומית בסיאול (מספר IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.אומדן שכיחות ותמותה מסרטן עולמי בשנת 2018: מקורות ושיטות של GLOBOCAN.פרשנות.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS תובנה לגבי גורמי הסיכון של גידולי מוח וההתערבויות הטיפוליות שלהם. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS תובנה לגבי גורמי הסיכון של גידולי מוח וההתערבויות הטיפוליות שלהם.Rashid, S., Rehman, K. and Akash, MS סקירה של גורמי סיכון לגידולי מוח והתערבויות טיפוליות גדולות. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS הבנה עמוקה של גורמי סיכון לגידול במוח והתערבויות טיפוליות.Rashid, S., Rehman, K. and Akash, MS סקירה של גורמי סיכון לגידולי מוח והתערבויות טיפוליות גדולות.מדע ביו - רפואי.רוֹקֵחַ.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. אינטראקציות חיידקיות-ויראליות בסרטן מערכת העיכול והמערכת הגניטליות של בני אדם: סיכום של עדויות אפידמיולוגיות ומעבדתיות. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. אינטראקציות חיידקיות-ויראליות בסרטן מערכת העיכול והמערכת הגניטליות של בני אדם: סיכום של עדויות אפידמיולוגיות ומעבדתיות.Kato I., Zhang J. ו- Sun J. אינטראקציות חיידקיות-ויראליות בסרטן של מערכת העיכול האנושית ודרכי המין הנשי: סיכום של נתונים אפידמיולוגיים ומעבדתיים. קאטו, אי., ז'אנג, ג'יי אנד סאן, ג'יי. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. אינטראקציה חיידקית-ויראלית בעיכול חלל הפה האנושי ובמערכת הרבייה הנשית: סיכום של מדע מחלות פופולריות ועדויות מעבדה.Kato I., Zhang J. ו- Sun J. אינטראקציות חיידקיות-ויראליות בסרטן מערכת העיכול בבני אדם וסרטן איברי המין הנשי: סיכום של נתונים אפידמיולוגיים ומעבדתיים.סרטן 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL מזיהום לסרטן: כיצד נגיפי גידול DNA משנים את חילוף החומרים המרכזי של פחמן ושומנים בתא המארח. Magon, KL & Parish, JL מזיהום לסרטן: כיצד נגיפי גידול DNA משנים את חילוף החומרים המרכזי של פחמן ושומנים בתא המארח.Mahon, KL ופריש, JL זיהום באש לסרטן: כיצד וירוסי גידול מבוססי DNA משנים את חילוף החומרים המרכזי של פחמן ושומנים בתא המארח. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL מזיהום לסרטן: כיצד נגיפי גידול DNA משנים את חילוף החומרים המרכזי של פחמן ושומנים בתא המארח.Mahon, KL ופריש, JL יורה זיהום לסרטן: כיצד נגיפי גידול DNA משנים את חילוף החומרים המרכזי של פחמן ושומנים בתאי מארח.ביולוגיה פתוחה.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.אסטרוגנים קטכולים של סקיסטוזומים וגלי כבד וסרטן הקשור להלמינת.חֲזִית.חם בפנים.5, 444 (2014).