Giardia duodenum הוא אורגניזם טפילי הגורם לגיארדאזיס, דלקת מעיים שכיחה במיוחד בילדים צעירים עם סימנים קליניים של שלשול.דיווחנו בעבר ש-G. duodenalis חוץ-תאי מפעיל את ההפעלה של נוקלאוטידים קושרים לקולטן תוך-תאי (NLRP3) ומווסת את התגובות הדלקתיות של המארח באמצעות הפרשת שלפוחית ​​חוץ-תאית (EV).עם זאת, נותרו להבהיר את הדפוסים המולקולריים המדויקים של הדואודנוקוקל EV (GEV) הקשורים לפתוגן המעורבים בתהליך זה ותפקידו של ה-NLRP3 inflammasome ב-giardiasis.
פלסמידים של ביטוי אוקריוטי רקומביננטי pcDNA3.1(+)-alpha-2 ו-alpha-7.3 giardins ב-GEV נבנו, הועברו למקרופאגים פריטוניאליים ראשוניים של עכברים, וזוהו על ידי מדידת מולקולת יעד הדלקת caspase-1.רמת הביטוי p20 נבדקה..G. duodenalis alpha-2 ו-alpha-7.3 giardines זוהו במקור על ידי מדידת NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 ו-caspase-1 p20), הפרשת IL.רמות 1β, רמות אוליגומריזציה של חלבון נקודתי אפופטוטי (ASC), ולוקליזציה חיסונית של NLRP3 ו-ASC.תפקידו של ה-NLRP3 inflammasome בפתוגניות של G. duodenalis הוערך לאחר מכן באמצעות עכברים בהם נחסמה הפעלת NLRP3 (עכברים חסומים NLRP3) ונוטרו שינויים פתולוגיים במשקל הגוף, עומס טפילי תריסריון ורקמות התריסריון.בנוסף, חקרנו האם hiardines alpha-2 ו-alpha-7.3 מעוררים הפרשת IL-1β in vivo דרך ה-NLRP3 inflammasome וקבענו את תפקידן של מולקולות אלו בפתוגניות של G. duodenalis בעכברים.
ג'יארדינים אלפא-2 ואלפא-7.3 גורמים להפעלה של ה-NLRP3 inflammasome in vitro.זה הוביל להפעלה של p20 caspase-1, עלייה ברמות הביטוי של חלבוני NLRP3, pro-IL-1β ו-pro-caspase-1, עלייה משמעותית בהפרשת IL-1β, היווצרות כתמי ASA ב ציטופלזמה, והשראת אוליגומריזציה של ASA.דלקת NLRP3 אובדן הפין מחמיר את הפתוגניות של G. duodenalis בעכברים.עכברים שטופלו בציסטות על ידי מתן מעכבים חסומים ב-NLRP3 הפגינו מספר מוגבר של טרופוזואיטים ונזק חמור לווילי התריסריון, המאופיינים בקריפטים נמקיים עם מכווצים והסתעפות.ניסויים in vivo הראו ש-giardines alpha-2 ו-alpha-7.3 יכולים לגרום להפרשה של IL-1β דרך ה-NLRP3 inflammasome, וחיסון עם giardines alpha-2 ו-alpha-7.3 הפחית את הפתוגניות של G. duodenalis בעכברים.
יחד, התוצאות של מחקר זה מצביעות על כך ש-giardia alpha-2 ו-alpha-7.3 גורמים לוויסות מוגברת של דלקת NLRP3 המארח ומפחיתים את הזיהומים של G. duodenalis בעכברים, שהם יעדים מבטיחים למניעת גיארדיזיס.
Giardia duodenum הוא טפיל פרוטוזואה חוץ תאי שחי במעי הדק וגורם ל-280 מיליון מקרים של ג'יארדיה עם שלשול מדי שנה, במיוחד בקרב ילדים צעירים במדינות מתפתחות [1].אנשים נדבקים בשתיית מים או מזון המזוהם בציסטות M. duodenum, אשר לאחר מכן חודרות לקיבה ומופרשות במיצי הקיבה.Giardia duodenum trophozoites נצמדים לאפיתל התריסריון, וגורמים לבחילות, הקאות, שלשולים, כאבי בטן וירידה במשקל.אנשים עם כשל חיסוני וסיסטיק פיברוזיס רגישים לזיהום.זיהום יכול להתרחש גם באמצעות מין אוראלי ואנאלי [2].תרופות כגון metronidazole, tinidazole ו-nitazoxanide הן אפשרויות הטיפול המועדפות בזיהומים בתריסריון [3].עם זאת, תרופות כימותרפיות אלו גורמות לתופעות לוואי שליליות כמו בחילות, קרצינוגנזה וגנוטוקסיות [4].לכן, יש לפתח אסטרטגיות יעילות יותר למניעת זיהום G. duodenalis.
Inflammasomes הם מחלקה של קומפלקסים של חלבון ציטוזולי שהם חלק מהתגובה החיסונית המולדת, המסייעים בהגנה מפני פלישת פתוגנים ומתווכים תגובות דלקתיות [5].בין הדלקות הללו, דלקת דמויית נוקלאוטיד-קושר אוליגומריזציה (NOD) קולטן 3 (NLRP3) נוקלאוטיד-קשור אוליגומריזציה (NLRP3) דלקת דמויית נוקלאוטיד-קושר נחקר בהרחבה מכיוון שניתן לזהות אותו על ידי דפוסים מולקולריים שונים הקשורים לפתוגן/נזק (PAMP/ DAMP), מזהה, מפעיל את מערכת החיסון המולדת.ומווסת הומאוסטזיס של המעי במחלות דלקתיות רבות [6,7,8].הוא מורכב מקולטן זיהוי הדפוסים (PRR) NLRP3, חלבון מנוקד אפופטוטי מתאם (ASC), ו-procaspase-1 או procaspase-11.ה-NLRP3 inflammasome פועל כמארח נגד פלישת פתוגנים, כפי שנצפה במחקרי Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] ו-Leishmania.[11], אך דווח גם שהפעלה של ה-NLRP3 inflammasome מגבילה תגובות חיסוניות הגנה ומחמירה את התקדמות המחלה, למשל, בתולעים [12].בהתבסס על הממצאים הקודמים שלנו, דיווחנו ש-G. duodenalis חוץ-תאי מעורר הפעלה תוך-תאית של דלקת NLRP3 ומווסת את התגובות הדלקתיות של המארח על ידי הפרשת שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) [13].עם זאת, תפקידו של ה-NLRP3 inflammasome בזיהום G. duodenalis in vivo עדיין לא נקבע.
ג'יארדינים תוארו במקור כמרכיבים מבניים של ציטושלד ה-G. duodenalis וממלאים תפקיד חשוב בתנועתיות טרופוזואיטים והצמדת תאי אפיתל במעי הדק.כדי להסתגל טוב יותר לסביבה ולהגביר את הפתוגניות שלהם, G. duodenalis trophozoites פיתחו מבנה ציטו-שלד ייחודי המורכב מ-8 דגלים, גוף אמצעי אחד ודיסק גחון אחד [14].הטרופוזואיטים של Giardia duodenum משתמשים בשלד הציטו שלהם כדי לחדור למעי הדק העליון, במיוחד לתריסריון, ולהיצמד לאנטרוציטים.הם נודדים כל הזמן ומתחברים לתאי אפיתל באמצעות מטבוליזם של התא.לכן, קיים קשר הדוק בין שלד הציטוס שלהם לבין ארסיות.ג'יארדינים הספציפיים ל-Giardia duodenum הם מרכיבים של מבנה הציטושלד [15] ומחולקים לארבע מחלקות: α-, β-, γ- ו-δ-giardines.ישנם 21 חברים ממשפחת α-giardin, שלכולם יש יכולת תלוית סידן לקשור פוספוליפידים [16].הם גם מחברים את שלד הציטו לממברנת התא.אצל אנשים עם שלשול הנגרם על ידי G. duodenalis, α-giardins מתבטאים מאוד ואימונראקטיביים במהלך זיהום [17].חיסונים הטרולוגיים המבוססים על Giardia alfa-1 מוגנים מפני ג'יארדאזיס בעכברים ומהווים אנטיגנים פוטנציאליים לפיתוח חיסון [18].אלפא-8 ג'יארדין, הממוקם בממברנת הפלזמה והפלגה, אך לא בדיסקת הגחון, משפר את התנועתיות וקצב הגדילה של trophozoites ב-G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin נצמד למבנים מיקרוטובוליים על דגלים ומשפיע על הכדאיות של G. duodenalis [20].ג'יארדין אלפא-11 קיים בשפע לאורך מחזור החיים, וביטוי יתר של ג'יארדין אלפא-11 פוגע ב-G. duodenalis עצמו [21].עם זאת, לא ברור אם אלפא-2 ג'יארדין ואלפא-7.3 ג'יארדין מגנים מפני זיהום G. duodenalis והמנגנונים הבסיסיים שלהם.
במחקר זה, פלסמידים של ביטוי אוקריוטי רקומביננטי pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ו-pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine הועברו למקרופאגים פריטוניאליים ראשוניים של עכברים כדי להפעיל NLRP3 המארח.לאחר מכן נבדקו מטרות דלקתיות.כמו כן, הערכנו את תפקידו של ה-NLRP3 inflammasome בפתוגניות של G. duodenalis, חקרנו האם אלפא-2 ו-alpha-7,3 giardines מעוררים הפעלה של ה-NLRP3 inflammasome in vivo, וקבענו ששני התפקידים הללו של giardines בפתוגניות של G. duodenalis.המטרה המשותפת שלנו הייתה לפתח מטרות מבטיחות למניעת זיהום G. duodenalis.
סוג פראי (WT) C57BL/6 עכברים נקבות בגילאי 5-8 שבועות נרכשו ממרכז החיות הניסוי של Liaoning Changsheng (ליאונינג, סין).לעכברים הייתה גישה חופשית למים, קיבלו מזון מעוקר והוחזקו במחזור אור/חושך של 12/12 שעות.לפני ההדבקה, עכברים קיבלו אנטיביוטיקה באופן חופשי במי שתייה בתוספת אמפיצילין (1 מ"ג/מ"ל), ונקומיצין (1 מ"ג/מ"ל) ונומיצין (1.4 מ"ג/מ"ל) (כולם נרכשו משנחאי, סין, אורגניזמים מלאכותיים) [22 ].].עכברים שאיבדו את היכולת לאכול ולשתות במשך יותר מ-24 שעות ואיבדו ≥ 20% ממשקל הגוף הומתו באופן אנושי על ידי פריקה צווארית.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, מנאסס, ארה"ב) נוספו עם 12.5% ​​סרום בקר עוברי (FBS; Every Green, Zhejiang, סין) ו-0.1% מרה בקר (Sigma-Aldrich, St. Missouri, ארה"ב ).ארה"ב) בתנאים מיקרו-אירוביים.טרופוזואיטים משולבים נאספו על קרח והועברו ביחס של 1:4 להמשך רבייה.
ציסטות של תריסריון Giardia הושרה כפי שתואר קודם [23], trophozoites נקצרו בשלב לוגריתמי ולאחר מכן דוללו במדיום מעורר אנקפסולציה, pH 7.1 (משתנה TYI-S-33) לריכוז סופי של 1 × 106 trophozoites/mL.ריכוז מרה 0.05% בינוני).טרופוזואיטים תורבו בתנאים אנאירוביים ב-37 מעלות צלזיוס עד לשלב הצמיחה הלוגריתמי.שנה את המדיום למדיום מעורר ציסטה (pH 7.8; מדיום TYI-S-33 שונה עם ריכוז מרה של 1%) והתרבות G. duodenalis ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48-96 שעות, במהלכן נצפו הציסטות היווצרות במיקרוסקופ.לאחר שרוב הטרופוזואיטים הוגרמו ליצירת ציסטות, תערובת התרבית נקצרה והושעתה מחדש במים סטריליים דה-יונים כדי לרזות את יתר הטרופוזואיטים.ציסטות נספרו ואוחסנו ב-4 מעלות צלזיוס לניתוחים הבאים דרך צינור קיבה בעכברים.
שלפוחיות חוץ-תאיות של Giardia (GEVs) הועשרו כפי שתואר קודם [13].טרפוזואיטים בשלב גדילה לוגריתמי הושעו מחדש במדיום שונה מסוג TYI-S-33 שהוכן עם FBS מדולדל אקזוזום (תעשיות ביולוגיות, בית-העמק, ישראל) לריכוז סופי של 1 × 106 טפילים/מ"ל והודגרו במשך 12 שעות.בודדו מהסופרנטנט של התרבות על ידי צנטריפוגה ב-2000 גרם למשך 10 דקות, 10,000 גרם למשך 45 דקות ו-100,000 גרם למשך 60 דקות.המשקעים הומסו במי מלח מאוחסנים בפוספט (PBS), כמתו באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) ואוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס או שימשו ישירות לניתוחים נוספים.
מקרופאגים פריטונאליים ראשוניים של עכברים הוכנו כמתואר קודם [24].בקצרה, לעכברים (בני 6-8 שבועות) הוזרק (תוך-צפקית [ip]) 2.5 מ"ל של מדיום תיוגליקול נוזלי Difco 2.98% (BD, Franklin Lakes, ניו ג'רזי, ארה"ב) והוזנו ב-3-4 חיכים.השעיה של מקרופאגים נאספה מחלל הבטן של עכברים לאחר המתת חסד ובוצעה בצנטריפוגה 3 פעמים ב-1000 גרם למשך 10 דקות.תאים שנאספו זוהו על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות סמן CD11b עד שטוהר התא היה מעל 98%, ולאחר מכן הוספו לצלחות תרבית תאים 6-בארות (4.5 x 106 תאים/באר) והודגרו עם 10% FBS (ביו-תעשייה) ב-37 מעלות צלזיוס.ו-5% CO2.
RNA הופץ מ-1 × 107 trophozoites ב-1 מ"ל מגיב TRIzol (Vazyme, Nanjing, סין), DNA גנומי הופץ מ-RNA G. duodenalis הכולל באמצעות MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, סין) ו-DNA משלים (cDNA) סונתז באמצעות MonScript RTIIII Super Mix (Monad) לפי הוראות היצרן.
מידע על רצף CDS עבור גן היעד G. duodenalis התקבל מה- NCBI GenBank.השתמש ב-Primer 5.0 כדי לעצב פריימרים לשיבוט חלקים ספציפיים עבור כל גן יעד.הפריימר קדימה (5′-3′) מורכב משלושה חלקים: רצף חופף עם וקטור לינאריזציה pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) וקודונים מתחילים ATG ו- GNN (אם הבסיס הראשון אינו G).זה נעשה כדי לשפר את היעילות של הביטוי.בנוסף, בסיסים משולבים של לפחות 16 bp (תכולת GC 40-60%/Tm כ-55 מעלות צלזיוס).הפריימר ההפוך (5′-3′) מורכב משני חלקים, רצף חופף עם וקטור עם EcoRV ליניאריזציה pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) ובסיס משולב של לפחות 16 bp.(לא כולל שתי התחנות האחרונות).בסיסים) קודון כגון AA או GA כדי לאפשר לפלסמידים רקומביננטיים לבטא את החלבונים המסומנים שלהם).רצפי הפריימר מופיעים בטבלה 1 וסונתזו על ידי Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, סין).
מטרות הוגברו באמצעות Pfu DNA פולימראז (Tiangen, בייג'ינג, סין) או Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., בייג'ינג, סין) תוך שימוש ב-G. duodenalis cDNA מוכן כתבנית.פלסמיד וקטור הביטוי האוקריוטי pcDNA3.1(+) עבר ליניאריזציה עם אנזים ההגבלה EcoRV ודפוספורילציה באמצעות Fast AP (Thermo Fisher Scientific).שברי pcDNA3.1(+) לינאריות ושברי גן מטרה מוגברים טוהרו באמצעות ערכת טיהור ג'ל DNA (Tiangen) וכומתו באמצעות Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).מקטע pcDNA3.1(+) וכל שבר גן מטרה שולבו מחדש באמצעות תערובת שיבוט מהרכבה יחידה של MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, סין) ואושרו על ידי רצף DNA באמצעות Comate Bioscience Company Limited (Changchun, סין)..
פלסמידים נטולי אנדוטוקסין pcDNA3.1(+)-alpha-2 ו-pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 נוצרו באמצעות ערכת המיני פלסמיד ללא אנדוטוקסין SanPrep (Sangon Biotech).הריכוז נשמר מעל 500 ng/µl כדי להבטיח שה-EDTA במאגר האלוציה לא הפריע למבחן הטרנספקציה.מקרופאגים פריטוניאליים ראשוניים של עכברים תורבו בצלחות 6-בארות עם מדיום RPMI 1640 מלא (תעשיות ביולוגיות) במשך 12 שעות, לאחר מכן התאים נשטפו 3 פעמים ב-PBS חם כדי להסיר פניצילין וסטרפטומיצין, ולאחר מכן במדיום בתוספת של מדיום שלם.פלסמידים נטולי אנדוטוקסין pcDNA3.1(+)-alpha-2 ו-pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 מיקרוגרם) דוללו ב-125 μl של מדיום סרום מופחת Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..לאחר מכן 5 µl של ריאגנט לטרנספקציה Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) דולל ב-125 µl של מדיום Opti-MEM בסרום נמוך.הכן קומפלקסים של ליפוזום-DNA על ידי ערבוב הפלסמיד המדולל ללא אנדוטוקסין עם Lipofectamine 2000 ומתן לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.מעבירים את הקומפלקסים בנפרד לתאים בכל באר ומערבבים לאט.לאחר 4 שעות, המדיום לתרבית התא הוחלף ב-2 מ"ל של מדיום RPMI 1640 מלא והתרבית נמשכה 24 שעות.מדיום תרבית תאים טרי הוסף לתאים והודגרה לנקודות זמן שונות בהתאם לתכנון הבדיקה.
דגימות חלבון מסופרנטנטים ומליזטים של תאים הוכנו כמתואר קודם [25].פרמטרי העברת ממברנה עבור pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin ו-His-tag היו 200 mA/90 דקות.עבור אינטרלוקין 1β (IL-1β; R&D Systems, מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"ב), קספאזה-1 (p20) (Adipogen, שוויץ) ו-NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, שוויץ) ו-1:5000 המכוונים לתג שלו (Amylet Scientific, ווהאן, סין) ו-β-אקטין (Proteintech, ווהאן, סין).
קישור צולב עם דיסוצ'ינימיד סוברט (DSS) בוצע כפי שתואר קודם [26].תאים נשטפו 3 פעמים עם PBS קר והוסרו לחלוטין עם מחט בגודל 27 במאגר תגובה של 50 μl ASC (pH 8.0) המכיל 25 מ"מ Na2PO4, 187.5 מ"מ NaCl, 25 מ"מ HEPES ו-125 מ"ל NaHCO3.התערובת עברה צנטריפוגה ב-5000 גרם למשך 3 דקות והגלולה נתפרה עם 10 μl DSS (25 מ"מ ב-DMSO) ו-40 μl חיץ תגובה ASC למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה ב-5000 גרם למשך 10 דקות, הכדור הומס בתמיסה של 40 μl של חיץ תגובה ASC ו- 10 μl של חיץ טעינת חלבון פי 6 (TransGen, בייג'ינג, סין), ולאחר מכן התמיסה נכבתה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקה, ואז להרתיח 10 דקות.לאחר מכן הועברו דגימות חלבון ל-Western blotting באמצעות נוגדנים אנטי-ASC ראשוניים (Wanleibio, Shenyang, סין) ביחס דילול של 1:500.
בעקבות הליך שתואר בעבר [13], נקצרו סופרנטנטים של תרבית תאים והפרשת הציטוקין הפרו-דלקתי IL-1β נקבעה באמצעות ערכת העכבר IL-1 Beta ELISA (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).המר ערכי OD450nm לריכוזי חלבון באמצעות עקומת התקן IL-1β.
תאים מצופים על כיסויי כיסוי נשטפו בעדינות 3 פעמים ב-PBS חם, קבוע בקיבוע תאי רקמה (Biosharp, בייג'ינג, סין) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ב-0.1% Triton X-Permeabilize ב-100 (מדולל ב-PBS; Biosharp ) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר וחוסמים ב-5% אלבומין בסרום בקר (ב-PBS) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר מכן הודגרו תאים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד ASC (דילול 1:100) או NLRP3 (דילול 1:100), בהתאמה, ועם Cy3 שכותרתו עז נגד ארנבת IgG(H+L) (1:400; EarthOx) , סן פרנסיסקו, קליפורניה, ארה"ב) או IgG נגד עכבר עיזים מצומדות ב-FITC (1:400; Earthox) למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בחושך למשך שעה.הגרעינים נצבעו ב-Hoechst 33258 (10 מיקרוגרם/מ"ל; UE, Suzhou, סין) למשך 5 דקות ונצפו במיקרוסקופ פלואורסצנטי (Olympus Corporation, טוקיו, יפן).
עכברים חולקו לארבע קבוצות (n = 7 בכל קבוצה): (i) קבוצת ביקורת שלילית שטופלה ב-PBS (PBS בלבד; מתן 100 µl/PBS של עכבר ואחריו הזרקה תוך-צפקית יומית 100 µl/עכבר PBS 3 שעות מאוחר יותר)., ברציפות במשך 7 ימים);(ii) קבוצת ביקורת שלילית שטופלה במעכבי MCC950 [27] (100 μl/עכבר באמצעות מתן PBS, 3 שעות מאוחר יותר, 10 מ"ג/ק"ג משקל גוף [BW] MCC950 [ב-PBS] ניתנה תוך-צפקית מדי יום, משך 7 ימים);(iii) קבוצת זיהום בציסטה G. duodenalis (1.5 x 106 ציסטות/עכבר על ידי מתן, 3 שעות מאוחר יותר, 100 μl/עכבר PBS ניתנת תוך צפקית מדי יום למשך 7 ימים);(iv) G. duodenalis ציסטה משולבת זיהום קבוצת טיפול מעכבי MCC950 (1.5×106 ציסטות/עכבר באמצעות מתן, 10 מ"ג/ק"ג משקל גוף MCC950 תוך צפק מדי יום במשך 7 ימים ב-3 שעות).משקל הגוף של כל עכבר נוטר מדי יום וכל העכברים הורדמו ביום השביעי.התריסריון שנאסף (אורך 3 ס"מ) נחתך לחתיכות קטנות ב-1 מ"ל PBS, ציסטות נהרסו לילה ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס, ו-G. duodenalis trophozoites.תריסריון טרי (אורך 1 ס"מ) בודד לצביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E).
עכברים חולקו לשתי קבוצות: (i) קבוצת ביקורת MOCK ו-(ii) קבוצת מעכבי MCC950.היו חמישה טיפולים בכל קבוצה (n = 7/קבוצת טיפול): (i) קבוצת ביקורת שלילית לטיפול ב-PBS (PBS בלבד; 100 µl PBS/עכבר, הזרקה תוך שרירית (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) קבוצת ביקורת שליליות של פלסמיד pcDNA3.1(+) (100 מיקרוגרם/דנ"א של עכבר, באמצעות הזרקה תוך שרירית) (iii) קבוצת ביקורת חיובית של זיהום בציסטה G. duodenalis (1.5 x 106 ציסטות/עכבר, באמצעות נתון) (iv) a); קבוצה שטופלה בפלסמיד pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 מיקרוגרם/DNA עכבר, בהזרקה תוך שרירית), ו-(v) קבוצה שטופלה בפלסמיד pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 מיקרוגרם/עכבר) DNA, לאחר 12 שעות של מעבר, עכברים בקבוצת מעכבי MCC950 קיבלו זריקה תוך-צפקית יומית של MCC950 (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) למשך 7 ימים, בעוד עכברים בקבוצת MOCK קיבלו נפח שווה של טיפול PBS. דגימות דם היו שנאספו מעכברי גלגלי העיניים ונשארו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בודדו באמצעות מבחן אימונוסורבנט מקושר אנזים (ELISA) עבור רמות IL-1β ומדידות.
שלושים וחמישה עכברים חולקו לחמש קבוצות (n=7/קבוצה).קבוצה 1 הייתה קבוצת ביקורת שלילית שטופלה ב-PBS: עכברים קיבלו 100 μl של PBS תוך שרירית ו-3 ימים לאחר מכן באמצעות מתן מתן.קבוצה 2 היא קבוצת ביקורת חיובית הנגועה בציסטות G. duodenalis: לעכברים הוזרקו 100 μl של PBS, ו-3 ימים לאחר מכן הוזרקו 1.5 x 106 ציסטות/עכבר תוך קיבה.קבוצה שלישית – חיסון פלסמיד עם pcDNA3.1(+) בשילוב עם קבוצת ביקורת לזיהום בציסטה התריסריון: עכברים קיבלו 100 מיקרוגרם של פלסמיד DNA pcDNA3.1(+)(im) דרך הפה, 1.5×106 ציסטות/עכבר 3 לכמה ימים.קבוצות 4 ו-5 היו רקומביננטיות pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid או pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid בשילוב עם זיהום בציסטה G. duodenalis.קבוצת ניסוי: עכברים קיבלו 100 מיקרוגרם של pcDNA3.1(+)-ג'יארדין פלסמיד DNA (im), ולאחר מכן 3 ימים לאחר מכן, 1.5 × 106 ציסטות/עכבר הוזרק באמצעות מתן.משקל הגוף של כל עכבר נוטר לאחר החדרת הציסטה G. duodenalis דרך הצינור.תריסריון טרי נאסף עבור מדידות עומס טפיליות וניתוח צביעת HE.
שינויים היסטופתולוגיים נותחו על פי נוהל שפורסם בעבר [30].התריסריון הטרי היה מקובע עם מקבע תאי רקמה, מוטבע בפרפין, חתך לקטעים של 4 מיקרון, נצבע ב-H&E ונותח תחת מיקרוסקופ אור.שינויים פתולוגיים מייצגים בשבעה קטעי רקמה משבעה עכברים עצמאיים הוערכו על ידי פתולוג שלא מודע לטיפול ונלכדו בהגדלה של פי 200.אורך ה-villi ועומק הקריפטים נמדדו בהתאם לשיטות שתוארו קודם לכן.
התוצאות in vitro ו-in vivo התקבלו בשלושה עותקים.גרפים נוצרו באמצעות GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ארה"ב).ההבדלים בין שתי קבוצות נותחו באמצעות t-test, בעוד שההבדלים בין ≥3 קבוצות נותחו על ידי ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) באמצעות תוכנת SPSS (גרסה 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, ארה"ב).הנתונים נותחו עבור הומוגניות של שונות באמצעות מבחן Levene ואחריו המבחן הפוסט-הוק של Bonferroni (B).המובהקות מתבטאת כ-P<0.05, P<0.01 ו-P<0.001 (לא מובהק [ns]) (P>0.05).
הניתוח הקודם שלנו של פרוטאומיקת GEV באנציקלופדיה של קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) הראה כי מטרות רבות עשויות להיות מעורבות בהפעלה של מסלולי איתות דלקתיים [13].בחרנו שני מטרות מבטיחות, אלפא-2 ואלפא-7.3 גיארדינים, מגבירים את המולקולות הללו ומשתמשים בהן לבניית וקטור הביטוי האיקריוטי pcDNA3.1(+).לאחר ריצוף, פלסמידים לביטוי גיארדין pcDNA3.1(+)-alpha-2 ו-alpha-7.3 רקומביננטיים הועברו למקרופאגים פריטוניאליים ראשוניים של עכברים, וזוהה חלבון החתימה caspase-1 p20 של דלקת (שבר של caspase-1 משופעל). כהבהרת מולקולות מפתח שיכולות לעורר דלקת.התוצאות הראו כי אלפא-2 ו-alpha-7.3 giardines יכולים לגרום לביטוי p20 caspase-1 בדומה ל-GEV.לא נמצאה השפעה על הפעלת caspase-1 בבקרה השלילית הבלתי מטופלת (PBS בלבד) ובביקורת הפלסמיד pcDNA3.1(+) (איור 1).
מדידה של הפעלת p20 caspase-1 על ידי pcDNA3.1(+)-alpha-2 ו-alpha-7.3 giardins.פלסמידים של ביטוי איקריוטי רקומביננטי pcDNA3.1(+)-alpha-2 ו-alpha-7.3 giardines (מעל כל נתיב) הועברו למקרופאגים פריטוניאליים ראשוניים של עכברים, וסופרנטנטים של תרבית נקצרו 24 שעות לאחר מכן.נעשה שימוש ב-Western blotting כדי למדוד את רמות הביטוי של חלבון ה-Caspase-1 p20 inflammasom החתימה.קבוצת הטיפול PBS בלבד (מסלול C) וקבוצת המונותרפיה pcDNA3.1(+) (pcDNA3.1 lane) שימשו כביקורת שלילית, וקבוצת הטיפול GEV שימשה כביקורת חיובית.ביטוי של החלבון הרקומביננטי אושר על ידי זיהוי תג היסטידין בכל חלבון, ורצועות החלבון הצפויות היו אלפא-2 גיארדין (38.2 kDa) ואלפא-7.3 גיארדין (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum extracellular vesicular, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearized vector, SUP, supernatant
כדי לקבוע אם אלפא-2 ג'יארדין וג'יארדין אלפא-7.3 מעוררים ביטוי p20 caspase-1 וממלאים תפקיד בהפעלת התגובה הדלקתית NLRP3 המארח, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ו-pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin הועבר למקרופאגים פריטוניאליים ראשוניים של עכברים עם DNA פלסמיד רקומביננטי, ונקבעו רמות ביטוי, לוקליזציה ואוליגומריזציה של חלבוני המפתח הדלקתיים NLRP3.בניסוי זה, GEV שימש כקבוצת הביקורת החיובית, וקבוצת הטיפול ללא טיפול (PBS בלבד) או קבוצת הטיפול בטרנספקציה pcDNA3.1(+) הייתה הקבוצה השלילית.התוצאות הראו שכמו בקבוצת GEV, DNA פלסמיד רקומביננטי של giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 ו-giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 הביאו לוויסות מעלה של NLRP3, pro-IL-1β ו הפעלת procaspase-1 ו-caspase-1 (איור 2a).בנוסף, שני הג'יארדינים גרמו להפרשה משמעותית של IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; ג'יארדין אלפא-2: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (איור 2ב).רוב חלבוני ה-ASC היו מונומריים בקבוצה ללא טיפול או בקבוצת הטיפול שהועברו עם הפלסמיד pcDNA3.1(+), בניגוד ל-pcDNA3.1(+)-alpha-2 או pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 ג'יארדין.אוליגומריזציה של ASC התרחשה ב-DNA של פלסמיד רקומביננטי של קבוצת הביקורת החיובית GEV או קבוצת הביקורת החיובית, המראה צורה אוליגומרית (איור 2c).נתונים ראשוניים אלו מצביעים על כך שאלפא-2 גיארדין ואלפא-7,3 גיארדין יכולים לגרום להפעלת דלקת NLRP3.מחקרים אימונופלורסנטים שלאחר מכן של לוקליזציה של ASC ו-NLRP3 הראו שבקבוצת הביקורת השלילית, חלבון ה-ASC היה מפוזר ברחבי הציטופלזמה והופיע כאות נקודה עם גירוי של pcDNA3.1(+)-alpha-2 עם giardine או pcDNA3.קבוצת 1(+)-alpha-7,3 giardine או קבוצת ביקורת חיובית GEV (איור 2d).בקבוצת הבקרה השלילית ובקבוצות pcDNA 3.1 שטופלו בפלסמיד, אות החלבון NLRP3 לא זוהה, בעוד שנקודת אות ניאון בתגובה ל-pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine או pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 זוהה..giardine נמצאים בציטופלזמה או עם גירוי של HEV (איור 2e).נתונים אלה מדגימים עוד כי G. duodenalis giardin alpha-2 ו-giardin alpha-7.3 מפעילים את ה-NLRP3 inflammasome במקרופאגים פריטוניאליים ראשוניים של עכברים.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin ו-pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin מפעילים את ה-NLRP3 inflammasome במקרופאגים צפקיים של עכברים.טרנספקט את פלסמידי הביטוי האוקריוטי הרקומביננטי pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin ו-pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin לתוך מקרופאגים ותאים פריטוניאליים עכברים ראשוניים, או קצור את הסופרנטנט בתוך 24 שעות לניתוח ביטוי, אוליגומריזציה , הפרשה.ולוקליזציה של חלבוני מפתח דלקתיים.קבוצת PBS בלבד (C) וקבוצת טיפול יחיד pcDNA3.1(+) שימשו כביקורת שלילית, וקבוצת הטיפול ב-GEV שימשה כקבוצה החיובית.חלבוני מפתח דלקתיים NLRP3, כולל NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 ו-p20 caspase-1, זוהו על ידי Western blotting.ב רמות ההפרשה של IL-1β בסופרנטנטים נקבעו באמצעות אנזים-linked immunosorbent assay (ELISA).ההבדלים בין קבוצות בקרה לניסויים נותחו על ידי ניתוח שונות של שונות (ANOVA) באמצעות תוכנת SPSS גרסה 22.0.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין הקבוצות **P<0.01 ו-***P<0.001.c רמות אוליגומריזציה של ASC בכדורים נקבעו על ידי ניתוח צולבות DSS, בעוד שרמות ASC בליזטים של תאים שימשו כבקרת טעינה.ד ויזואליזציה של לוקליזציה של ISC באמצעות אימונופלואורסצנטי.e Immunofluorescence שימש כדי להמחיש את הלוקליזציה של NLRP3.ASC, חלבון דמוי כתם אפופטוטי;IL, interleukin;NLRP3, קולטן דמוי אוליגומריזציה קושר נוקלאוטידים 3;ns, לא מובהק (P > 0.05)
גם G. duodenalis וגם GEVs שהוא מפריש מפעילים את ה-NLRP3 inflammasome ומווסתים את התגובות הדלקתיות המארח במבחנה.לפיכך, תפקידו של ה-NLRP3 inflammasome בפתוגניות של G. duodenalis נותר לא ברור.כדי לחקור נושא זה, תכננו ניסוי בין עכברים שנדבקו בציסטה G. duodenalis לבין עכברים שנדבקו בציסטה G. duodenalis + טיפול מעכבי MCC950 והשווינו ביטוי דלקתי של NLRP3 כאשר נדבקו בציסטה G. duodenalis.סכימה מפורטת של הניסוי מוצגת באיור 3א.שינויים במשקל הגוף של עכברים בקבוצות טיפול שונות נוטרו במשך 7 ימים לאחר ההדבקה בציסטות, והתוצאות מוצגות באיור 3b.בהשוואה לקבוצה שטופלה ב-PBS טהור, התוצאות הראו כי (i) משקל הגוף של עכברים שנדבקו בציסטה G. duodenalis ירד מיום 3 ליום 7 לאחר ההדבקה;(ii) לטיפול במעכב MCC950 לא הייתה השפעה משמעותית על משקל הגוף של העכברים..בהשוואה לקבוצת הזיהום היחיד, ה-BW של קבוצת הזיהום בתריסריון שטופלה ב-MCC950 ירד בדרגות שונות (יום 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; יום 2: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; יום 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052: A (3, 24)=0.6497, P=0.0645; יום 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202).נתונים אלה מוכיחים שה-NLRP3 inflammasome מגן על עכברים מפני ירידה משמעותית במשקל בשלבים המוקדמים (2-4 ימים) של זיהום בתריסריון.לאחר מכן שאפנו לזהות trophozoites G. duodenalis בנוזל שטיפה בתריסריון והתוצאות מוצגות באיור 3c.בהשוואה לקבוצת הזיהום בציסטה G. duodenalis, מספר הטרופוזואיטים בתריסריון עלה באופן משמעותי לאחר חסימת ה-NLRP3 inflammasome (t(12) = 2.902, P = 0.0133).רקמות התריסריון שנצבעו ב-HE הראו, בהשוואה לבקרה שלילית שטופלה ב-PBS ו-MCC950 בלבד: (i) זיהום בציסטה G. duodenalis הביא לנזק לבלאי התריסריון (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P=0.0488 ) וניוון קריפטה (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) תריסריון מעכברים שנדבקו בציסטות G. duodenalis וטופלו במעכבי MCC950.שרירי התריסריון היו פגומים ומתים (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) עם ניוון והסתעפות קריפטה (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (איור 3d- ו) .תוצאות אלו מצביעות על כך ש-NLRP3 inflammasome ממלא תפקיד בהפחתת הפתוגניות של G. duodenalis.
תפקידו של דלקת NLRP3 בזיהום בתריסריון Giardia.עכברים טופלו עם או בלי MCC950 (ip).קבוצות טיפול בודדות עם PBS או MCC950 שימשו כביקורות.קבוצת ניסוי ומשטר טיפול.ב מעקב אחר משקל הגוף של עכברים בכל אחת מקבוצות הטיפול השונות במשך 7 ימים.ההבדל בין קבוצת הזיהום G. duodenalis לקבוצת הטיפול בזיהום G. duodenalis + MCC950 נותח על ידי בדיקת t באמצעות תוכנת SPSS גרסה 22.0.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים ב-*P<0.05, **P<0.01 או ***P<0.001.ג עומס טפילי נקבע על ידי ספירת מספר הטרופוזואיטים בנוזל שטיפת התריסריון.ההבדל בין קבוצת הזיהום G. duodenalis לקבוצת הטיפול בזיהום G. duodenalis + MCC950 נותח על ידי בדיקת t באמצעות תוכנת SPSS גרסה 22.0.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים ב-*P < 0.05.ד תוצאות צביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E) של היסטופתולוגיה של התריסריון.חיצים אדומים מציינים נזק לווילי, חיצים ירוקים מציינים נזק לקריפטות.סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.e, f ניתוח סטטיסטי של גובה הווילוס התריסריון וגובה קריפטת העכבר.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים ב-*P<0.05 ו-**P<0.01.התוצאות לקוחות מ-7 ניסויים ביולוגיים עצמאיים.BW, משקל גוף;ig, נתיב לידה תוך קיבה;ip, נתיב לידה תוך פריטונאלי;ns, לא מובהק (P > 0.05);PBS, פוספט buffed saltine;WT, סוג פראי
הפרשת IL-1β היא סימן היכר של הפעלת דלקת.כדי לקבוע אם G. duodenalis alpha-2 giardine ו-alpha-7.3 giardine מפעילים את הדלקת המארח NLRP3 in vivo, השתמשנו בעכברי WT לא מטופלים (קבוצת דמה) ובעכברים חסומים בדלקת NLRP3 (קבוצת טיפול מעוכבת MCC950).סכימה מפורטת של הניסוי מוצגת באיור 4א.קבוצות הניסוי כללו עכברים שטופלו ב-PBS, טיפול בציסטה G. duodenalis על ידי נתיחה, הזרקה תוך שרירית של pcDNA3.1 והזרקה תוך שרירית של pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine או pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.ביום השביעי לאחר מתן תוך שרירי של הפלסמיד הרקומביננטי, נאסף סרום ונקבעה רמת IL-1β בכל קבוצה.כפי שמוצג באיור 4b, בקבוצת MOCK: (i) בהשוואה לקבוצת PBS, לטיפול ב-pcDNA3.1 לא הייתה השפעה משמעותית על הפרשת IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), עם זאת, הפרשת IL-β עלתה משמעותית בקבוצת ציסטות G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine ו-pcDNA3.1- הזרקה תוך שרירית של אלפא-7.3 ג'יארדין העלתה משמעותית את רמות IL-1β בסרום (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine גרמה לרמות גבוהות של הפרשת IL-1β בקבוצת ההזרקה לשריר pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .בהשוואה לכל קבוצה בקבוצת הטיפול ב-MCC950 ובקבוצת MOCK: (i) רמות הפרשת IL-1β בקבוצת הביקורת PBS ובקבוצת הביקורת pcDNA3.1 ירדו במידה מסוימת לאחר חסימת מעכב ה-MCC950, אך ההבדל לא היה משמעותי (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) לאחר חסימת MCC950., הפרשת IL-1β הופחתה באופן משמעותי בקבוצה הנגועה בציסטה G. duodenalis, קבוצת pcDNA3.1-alpha-2 giardine וקבוצת giardine pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3.540, P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(9,; ) = 3.540, P = 0.0164).תוצאות אלו מצביעות על כך ש-alpha-2 giardine ו-alpha-7.3 giardine מתווכים את ההפעלה של ה-NLRP3 inflammasome in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines מפעילים את הדלקת המארח NLRP3 in vivo.עכברים חוסנו (IM) עם פלסמיד ביטוי איקריוטי רקומביננטי pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine או pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ולאחר מכן טופלו עם MCC950 (ip; קבוצת MCC950) או לא (קבוצת דמה) ).קבוצת הטיפול בפלסמיד PBS או pcDNA3.1(+) שימשה כביקורת שלילית, קבוצת הטיפול בציסטה G. duodenalis שימשה כביקורת חיובית.קבוצת ניסוי ומשטר טיפול.b רמות IL-1β בסרום בעכברים נמדדו ביום 7 על ידי מבחן ELISA.ההבדלים בין הקבוצות בקבוצת MOCK נותחו באמצעות ANOVA חד כיווני, וההבדלים בין קבוצת MOCK לקבוצת MCC950 נותחו באמצעות מבחן t של תוכנת SPSS גרסה 22.0.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין קבוצות הטיפול בקבוצת MOCK, *P<0.05 ו-***P<0.001;סימני דולר ($) מצביעים על הבדלים משמעותיים בין כל קבוצה בקבוצת MOCK לבין קבוצת MCC950 ב-P<0.05.תוצאות של שבעה ניסויים ביולוגיים עצמאיים.i, הזרקה תוך שרירית, ns, לא משמעותי (P > 0.05)
כדי לחקור את ההשפעה של הפעלה מתווכת אלפא-2 ואלפא-7.3 של ג'יארדין של דלקת המארח NLRP3 על זיהום G. duodenalis, השתמשנו בעכברי WT C57BL/6 והזרקנו אלפא-2 ג'יארדין ואלפא-7.3 גיארדין.הפלסמיד הוזרק לשריר, לאחר 3 ימים דרך צינור הקיבה של ציסטה G. duodenalis, ולאחר מכן נצפו העכברים במשך 7 ימים.סכימה מפורטת של הניסוי מוצגת באיור 5א.משקל הגוף של כל עכבר נמדד מדי יום, דגימות של רקמת תריסריון טרייה נאספו ביום ה-7 לאחר המתן דרך צינור קיבה, נמדד מספר הטרופוזואיטים ונצפו שינויים היסטופתולוגיים.כפי שמוצג באיור 5b, עם הגדלת זמן ההאכלה, ה-BW של עכברים בכל קבוצה גדל בהדרגה.ה-MT של עכברים החל לרדת ביום השלישי לאחר מתן תוך קיבה של ציסטות G. duodenalis, ולאחר מכן עלה בהדרגה.הפעלת ה-NLRP3 inflammasome המושרה על ידי הזרקה תוך שרירית של אלפא-2 ג'יארדין וג'יארדין אלפא 7.3 הפחיתה משמעותית את הירידה במשקל בעכברים (יום 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 יום 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 יום 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; יום 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 יום 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 יום 4: pcDNA3.1-alpha-2 giard , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, יום 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, יום 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 יום 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 יום 6: pcDNA3 . alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Day 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;יום 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 יום 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).העומס הטפילי הוערך בתריסריון (איור 5c).בהשוואה לבקרה החיובית הבלתי מטופלת ולקבוצה שהוזרק עם וקטור pcDNA3.1 הריק, מספר הטרופוסואיטים של G. duodenalis הופחת משמעותית בקבוצות שהוזרקו עם α-2 גיארדין ו-α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha) -2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).בנוסף, giardine alfa-7.3 היה מגן יותר בעכברים מאשר giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).התוצאות של צביעה HE מוצגות באיור.5ד–ו.לעכברים שהוזרקו אלפא-2 ג'יארדין ואלפא-7.3 ג'יארדין היו פחות נגעים ברקמת התריסריון, שהתבטאו בנזק לווילוס, בהשוואה לעכברים שהוזרקו עם G. duodenalis ועכברים שהוזרקו עם G. duodenalis בשילוב עם וקטור pcDNA3 ריק .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 או P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 או P = 0.0055) וניוון קריפטי מופחת (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 או P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA giardine , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 או P = 0.0191).תוצאות אלו מצביעות על כך ש-alpha-2 giardine ו-alpha-7,3 giardine מפחיתים את הזיהום של G. duodenalis על ידי הפעלת ה-NLRP3 inflammasome in vivo.
תפקיד של pcDNA3.1(+)-giardins בזיהום G. duodenalis.עכברים חוסנו (IM) עם פלסמידים של ביטוי אוקריוטי רקומביננטי pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine או pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ולאחר מכן אותגרו עם ציסטות G. duodenalis (ig).קבוצת PBS וקבוצת הטיפול בציסטה תריסריון + pcDNA3.1(+) שימשו כקבוצות ביקורת שליליות, וקבוצת הטיפול בציסטה התריסריון שימשה כקבוצת ביקורת חיובית.קבוצת ניסוי ומשטר טיפול.ב-MT של עכברים בכל אחת מקבוצות הטיפול השונות נוטר במשך 7 ימים לאחר האתגר.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין קבוצות בקבוצת G. duodenalis וקבוצת pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P <0.05, **P <0.01 ו-***P <0.001;סימן הדולר ($) מציין הבדל משמעותי בין כל קבוצה של G. duodenalis וקבוצת jardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3, $$P<0.01 ו-$$$P<0.001.ג עומס טפילי נקבע על ידי ספירת מספר הטרופוזיטים ב-1 מ"ל של שטיפת תריסריון מהתריסריון (אורך 3 ס"מ) ומבוטא כמספר הטפילים לס"מ תריסריון.ההבדלים בין קבוצת הזיהום G. duodenalis, קבוצת pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine וקבוצת pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine נותחו על ידי ANOVA חד כיווני באמצעות תוכנת SPSS גרסה 22.0.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים ב-**P<0.01 ו-***P<0.001.ד שינויים היסטופתולוגיים בתריסריון.חיצים אדומים מציינים נזק לווילי, חיצים ירוקים מציינים נזק לקריפטות.סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.e, f ניתוח סטטיסטי של גובה תריסריון עכבר (e) וגובה קריפטה (f).ההבדלים בין הקבוצות באיור 1d נותחו על ידי ANOVA חד כיווני באמצעות תוכנת SPSS גרסה 22.0.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים ב-*P<0.05 ו-**P<0.01.תוצאות של שבעה ניסויים ביולוגיים עצמאיים.ns, לא מובהק (P > 0.05)
Giardia duodenum הוא טפיל מעיים ידוע של בני אדם ויונקים אחרים הגורם לג'יארדאזיס.בשנת 2004, הוא נכלל ביוזמת המחלות המוזנחות של ארגון הבריאות העולמי בשל השכיחות הגבוהה שלו במשך 6 שנים, במיוחד בקהילות בעלות מעמד סוציו-אקונומי נמוך [32].למערכת החיסון המולדת תפקיד קריטי בתגובה החיסונית לזיהום G. duodenalis.דווח כי מקרופאגים של עכברים בולעים והורגים את G. duodenalis על ידי שחרור מלכודות חוץ-תאיות [33].מחקרים קודמים שלנו הראו ש-G. duodenalis, טפיל חוץ-תאי לא פולשני, מפעיל מסלולי איתות דלקתיים של p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 ו-NLRP3 במקרופאגים של עכברים כדי לווסת תגובות דלקתיות מארח, ו-GEV משוחרר עשוי לשפר תהליך זה.יג], כ”ד].עם זאת, נותרו להבהיר את ה-PAMPs המדויקים המעורבים בדלקת מווסתת NLRP3 inflammasome ב-GEV ואת תפקידו של NLRP3 inflammasome ב-giardiasis.כדי לשפוך אור על שתי השאלות הללו, ערכנו את המחקר הזה.
ה-NLRP3 inflammasome ממוקם בציטופלזמה של תאי מערכת החיסון וניתן להפעיל אותו על ידי חלקיקים שונים כגון גבישי חומצת שתן, רעלנים, חיידקים, וירוסים וטפילים.במחקרי חיידקים, רעלים זוהו כ-PAMPs מפתח המפעילים חיישנים דלקתיים, המובילים לדלקת ולמוות של תאים [34].כמה רעלים מגוונים מבחינה מבנית, כגון המוליזין מ- Staphylococcus aureus [35] ו- Escherichia coli [36], המוליזין BL (HBL) מאנטרוטוקסין (NHE) [37], גורמים להפעלה של דלקת NLRP3.מחקרים ויראליים הראו שחלבוני ארסיות כגון חלבון SARS-COV-2 מעטפת (E) [38] וחלבון Zika virus NS5 [39] הם PAMPs חשובים המוכרים על ידי הקולטן NLRP3.במחקרי טפילים, דווח כי טפילים רבים קשורים להפעלת דלקת דלקת מארח, כגון Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] ולישמניה [42].חלבוני הגרגיר הצפופים GRA35, GRA42 ו-GRA43, הקשורים לארסיות של Toxoplasma gondii, נדרשים להשראת פירופטוזיס במקרופאגים של חולדה לואיס [43].בנוסף, כמה מחקרי Leishmania התמקדו במולקולות בודדות המעורבות ב-NLRP3 inflammasome, כגון טפיל קרום ליפופוספוגליקן [44] או אבץ metalloprotease [45].בין משפחת הגנים דמויי אנקסין, אלפא-1 ג'יארדין הוכח כמועמד פוטנציאלי לחיסון המספק הגנה מפני G. duodenalis במודל עכבר [18].במחקר שלנו, בחרנו את גורמי הארסיות של G. duodenalis alpha-2 ו-alpha-7,3 giardines, שהם ייחודיים ל-giardia אך פחות מדווחים יחסית.שני גנים מטרה אלו שובטו לתוך וקטור מערכת הביטוי האיקריוטית pcDNA3.1(+) לצורך ניתוח של הפעלת דלקת.
במודל העכבר שלנו, שברי קספאז מפוצלים משמשים כסמנים של הפעלה דלקתית.עם גירוי, NLRP3 מקיים אינטראקציה עם ASC, מגייס פרוקספסות, ומייצר קספזות פעילות המחלקות פרו-IL-1β ו-pro-IL-18 ל-IL-1β ו-IL-18 בוגרים, בהתאמה -18.קספאזות דלקתיות (קספסות-1, -4, -5 ו-11) הן משפחה משומרת של ציסטאין פרוטאזות שהן קריטיות להגנה מולדת ומעורבות בדלקת ובמוות תאי מתוכנת [46].Caspase-1 מופעל על ידי דלקות קנוניות [47], בעוד קספאזות-4, -5 ו-11 מתפצלות במהלך היווצרות דלקות לא טיפוסיות [48].במחקר זה, השתמשנו במקרופאגים צפקיים של עכברים כמודל וחקרנו את p20 caspase-1 מפוצל caspase-1 כסמן להפעלת דלקת המארח NLRP3 במחקרים על זיהום G. duodenalis.התוצאות הראו כי אלפא-ג'יארדינים רבים אחראים להפעלה האופיינית של דלקת, דבר העולה בקנה אחד עם גילוי מולקולות ארסיות מפתח המעורבות בחיידקים ובנגיפים.עם זאת, המחקר שלנו הוא רק מסך ראשוני וישנן מולקולות אחרות שיכולות להפעיל דלקות לא קלאסיות, שכן המחקר הקודם שלנו מצא דלקות קלאסיות ולא קלאסיות בזיהום G. duodenalis [13].כדי לקבוע עוד יותר האם ה-p20 caspase-1 שנוצר קשור ל-NLRP3 inflammasome, העברנו ג'יארדינים אלפא-2 ואלפא-7.3 למקרופאגים צפקיים של עכברים כדי לקבוע את רמות ביטוי חלבון מולקולה מפתח ורמות אוליגומריזציה של ASC, מה שמאשר ששני ה-α-giardins מופעלים inflammasome NLRP3.התוצאות שלנו שונות במקצת מאלו של Manko-Prykhoda וחב', שדיווחו שגירוי של תאי Caco-2 עם זני G. muris או E. coli EPEC בלבד יכולים להגביר את עוצמת הקרינה של NLRP3, ASC ו-Caspase-1, אם כי לא באופן משמעותי, בעוד כיצד קוסטימולציה של G. muris ו-E. coli העלתה את רמות שלושה חלבונים [49].אי התאמה זו עשויה לנבוע מהבדלים בבחירה של מיני Giardia, שורות תאים ותאים ראשוניים.ביצענו גם מבחני in vivo באמצעות MCC950 בעכברי נקבות WT C57BL/6 בנות 5 שבועות, הרגישות יותר ל-G. duodenalis.MCC950 הוא מעכב NLRP3 מולקולה קטנה חזקה וסלקטיבית החוסמת הפעלה קנונית ולא קנונית של NLRP3 בריכוזים ננומולריים.MCC950 מעכב את הפעלת NLRP3 אך אינו משפיע על ההפעלה של מסלולי דלקת AIM2, NLRC4 ו-NLRP1 או מסלולי איתות TLR [27].MCC950 חוסם את הפעלת NLRP3 אך אינו מעכב את התחלת NLRP3, פליטת K+, זרימת Ca2+ או את האינטראקציה בין NLRP3 ל-ASC;במקום זאת, הוא מעכב את הפעלת NLRP3 inflammasome על ידי חסימת אוליגומריזציה של ASC [27].לכן, השתמשנו ב-MCC950 במחקר in vivo כדי לקבוע את תפקידו של דלקת NLRP3 לאחר הזרקת ג'יארדין.Caspase-1 p10 מופעל מבקע ציטוקינים פרו-דלקתיים פרו-IL-1β ו-pro-IL-18 ל-IL-1β ו-IL-18 בוגרים [50].במחקר זה, רמות IL-1β בסרום בעכברים שטופלו בג'יארדין עם או בלי MCC950 שימשו כאינדיקטור לשאלה האם ה-NLRP3 inflammasome הופעל.כצפוי, טיפול ב-MCC950 הפחית משמעותית את רמות ה-IL-1β בסרום.נתונים אלו מדגימים בבירור ש-G. duodenalis giardin alfa-2 ו-giardin alfa-7.3 מסוגלים להפעיל את ה-NLRP3 inflammasome עכבר.
נתונים משמעותיים שהצטברו במהלך העשור האחרון הוכיחו ש-IL-17A הוא הרגולטור הראשי של חסינות נגד G. muris, גורם לאיתות IL-17RA, ייצור פפטידים אנטי-מיקרוביאליים ומווסת את הפעלת המשלים [51].עם זאת, זיהום Giardia מתרחש בתדירות גבוהה יותר במבוגרים צעירים, ודווח כי זיהום Giardia בעכברים צעירים אינו מפעיל את תגובת IL-17A כדי להפעיל את השפעתה המגנה [52], מה שגרם לחוקרים לחפש אחר Giardia אימונומודולטורית אחרת.מנגנונים של זיהום הלמינת.מחברי מחקר שנערך לאחרונה דיווחו כי G. muris יכול להפעיל את ה-NLRP3 inflammasome על ידי E. coli EPEC, אשר מקדם ייצור של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים ומפחית את יכולת ההתקשרות שלו ואת מספר הטרופוזואיטים במערכת המעי, ובכך מפחית את חומרת המעי הגס. מחלות הנגרמות על ידי bacilli [49].ה-NLRP3 inflammasome מעורב בהתפתחות של מחלות שונות.מחקרים הראו כי Pseudomonas aeruginosa מעורר אוטופגיה במקרופאגים כדי למנוע מוות של תאים, ותהליך זה תלוי בהפעלה של ה-NLRP3 inflammasome [53].עבור N. caninum, הפעלה בתיווך מיני חמצן תגובתי של ה-NLRP3 inflammasome מגבילה את שכפולו במארח, מה שהופך אותו למטרה טיפולית פוטנציאלית [9].נמצא כי Paracoccidioides brasiliensis משרה את ההפעלה של ה-NLRP3 inflammasome בתאים דנדריטים שמקורם במח עצם של עכבר, וכתוצאה מכך לשחרור הציטוקין הדלקתי IL-1β, הממלא תפקיד קריטי בהגנה על המארח [10].מספר מיני Leishmania, כולל L. amazonensis, L. major, L. braziliensis ו-L. infantum chagasi, מפעילים NLRP3 ו-ASC תלוי caspase-1 במקרופאגים, כמו גם זיהום Leishmania.שכפול הטפיל משופר בעכברים הסובלים מחוסר בגן NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.דווח כי זיהום בלישמניה גורם להפעלה של הדלקת NLRP3 במקרופאגים, אשר מגביל את שכפול הטפיל התוך תאי.לפיכך, לישמניה עשויה לעכב את הפעלת NLRP3 כאסטרטגיית הימנעות.במחקרים in vivo, ה-NLRP3 inflammasome תרם לחיסול הלישמניה, אך לא השפיע על רקמות [54].לעומת זאת, במחקרי הלמינתיאזיס, הפעלה של דלקת ה-NLRP3 דיכאה את חסינות ההגנה של המארח מפני הלמינתיאזיס במערכת העיכול [12].שיגלה הוא אחד החיידקים העיקריים הגורמים לשלשולים ברחבי העולם.חיידקים אלה יכולים לגרום לייצור IL-1β באמצעות קולטן P2X7 פליטת K+, מיני חמצן תגובתיים, החמצה ליזוזומלית ונזק למיטוכונדריה.ה-NLRP3 inflammasome מווסת באופן שלילי פגוציטוזיס ופעילות חיידקית של מקרופאגים נגד Shigella [55].מחקרי פלסמודיום הראו כי עכברים חסרי AIM2, NLRP3 או קספסה-1 הנגועים בפלסמודיום מייצרים רמות גבוהות של אינטרפרון מסוג 1 ועמידים יותר לזיהום פלסמודיום [56].עם זאת, תפקידם של אלפא-2 ג'יארדין ואלפא-7.3 גיארדין בהשראת הפעלה פתוגנית של דלקת NLRP3 בעכברים אינו ברור.
במחקר זה, עיכוב של ה-NLRP3 inflammasome על ידי MCC950 הפחית את BW והגדיל את מספר הטרופוזואיטים בנוזל שטיפת מעיים בעכברים, וכתוצאה מכך לשינויים פתולוגיים חמורים יותר ברקמת התריסריון.ג'יארדין אלפא-2 וג'יארדין אלפא-7.3 מפעילים את ה-NLRP3-inflammasome של העכבר המארח, מעלים את משקל הגוף של העכבר, מפחיתים את מספר הטרופוזואיטים בנוזל שטיפת המעיים ומקלים על נגעים פתולוגיים בתריסריון.תוצאות אלו מצביעות על כך ש-G. duodenalis יכול להפעיל את ה-NLRP3-inflammasom המארח באמצעות אלפא-2 גיארדין ואלפא-7,3 ג'יארדין, להפחית את הפתוגניות של G. duodenalis בעכברים.
ביחד, התוצאות שלנו מוכיחות ש-alpha-2 ו-alpha-7.3 giardines מעוררים את ההפעלה של ה-NLRP3 המארח inflammasome ומפחיתים את הזיהומים של G. duodenalis בעכברים.לכן, מולקולות אלה הן מטרות מבטיחות למניעת גיארדאזיס.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.ג'יארדאזיס: סקירה כללית.לאחרונה נחשף כי פאט אינפלם אלרגי לתרופות.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: סקירה של טיפול תרופתי.חוות דעת מומחה של רוקח.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.ג'יארדאזיס, עמידות לתרופות וגילוי מטרות חדשות.מדביק מטרות סמים של Disord.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T וכו'. NLRP3 מחלות דלקתיות ודלקתיות.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. תפקידו של ה-inflammasome בדלקת מעיים וסרטן.גסטרואנטרולוגיה.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. הפעלה דלקתית קנונית ולא טיפוסית של NLRP3 בצומת הדרכים של סובלנות חיסונית ודלקת מעיים.טרום חיסון.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, ועוד.הפעלת NLRP3 inflammasome בתיווך ROS מעורבת בתגובה לזיהום N. caninum.וקטור טפיל.2020;13:449.